專利名稱：一種用于同時檢測5種豬病病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒及引物和探針的制作方法
技術領域：
本發明提供了一種用于檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒及引物和探針，可實現一次采樣，一次分析，同時檢測5種豬病的目的，屬于檢驗檢疫領域。
背景技術：
豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(FMDV)是引起豬呼吸道疾病、繁殖障礙和消化道疾病的主要常見病原，是危害養豬業最為嚴重的幾種病原，被世界動物衛生組織規定為跨界傳播病原，也是我國動物及動物產品國際貿易中重要的檢疫對象。
目前，針對上述5種豬病病原建立了多種分子檢測技術，如PCR和熒光PCR技術等，在這些疫病的診斷和防控中發揮了重要的作用。但目前所建立的方法多是針對一種病原的單獨檢測技術，在實際檢測中需要重復多次完成檢測不同病原的目的，檢測工作量大且時間長，不能滿足大批量動物檢疫快速通關的實際需要。且難以實現現地樣品中大量存在的混合感染以及癥狀相似疫病的鑒別診斷。在建立單獨疫病檢測技術的同時，各國獸醫機構也相繼研制了可同時檢測豬常見病毒的多重PCR及多重熒光PCR，但傳統PCR技術靈敏度低、結果不易判定等缺點限制了其在多重檢測中的應用，而熒光PCR由于不同探針采用的突光集團所發射的突光存在相互干擾，且突光PCR儀對不同波長突光分辨的局限性也限制了熒光PCR多重檢測技術的發展。多重連接探針擴增技術(Multiplexligation-dependent probeamplification, MLPA)由荷蘭的Schouten博士首先發明，是一種操作簡便、成本低廉的新型技術，目前在遺傳疾病、基因甲基化分析等多個領域中得到了廣泛應用。MLPA的原理是將核酸的雜交檢測和PCR鏈式擴增相結合，從而實現靶分子的高效特異性分析。其核心技術是合成序列特異的長探針和短探針。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴增的通用引物，一段是病毒特異性序列。長探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴增的通用引物和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列(指紋序列)。當MLPA的兩種探針結合到彼此相鄰的靶序列上的時候，在連接反應時，長探針就和短探針發生連接，生成一條兩端分別含有上下游通用引物的全長探針，并在通用引物的擴增之下，使模板成鏈式放大，實現靶分子的高靈敏度檢測，其檢測極限可達3000-6000個靶分子拷貝。MLPA并不是擴增病毒特異的靶序列，而是擴增與病毒靶序列結合的探針，換句話說，首先是給每種病毒的長探針加入特定大小的指紋序列，然后通過通用引物將不同的“指紋”擴增表現出來，最后通過對“指紋”的分析，實現多種核酸的檢測，同時序列特異的兩段探針確保了每種病原的指紋具有高度的特異性。MLPA在擴增靈敏性、特異性等方面是對傳統PCR方法的顯著改進，同時其良好的多重性能，一次反應可以實現45種以上靶分子的檢測，也突破了實時熒光PCR在多重性方面的“瓶頸”。
本研究利用多重連接探針擴增技術(MLPA)在核酸檢測方面具有的特異、敏感，適合多重檢測等優點，建立了 SIV、PRRSV, PRV、TGEV, FMDV五種豬病病原的MLPA檢測方法并組裝成試劑盒，在國內外首次實現一次采樣，一次分析，檢測5種重要豬病的目的，不僅減少了檢測的工作量和成本，且能在最短的時間內完成疫病的檢測，為疾病防制爭得時間。

發明內容
本發明的第一個目的是提供特異性強、靈敏度高的同時檢測豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和口蹄疫病毒(FMDV)的多重連接探針及一對通用引物。本發明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的同時檢測豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和
口蹄疫病毒(FMDV)的多重連接探針擴增檢測試劑盒。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案在序列比對分析的基礎上，針對豬流感病毒M基因、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒N基因、偽狂犬病病毒gB基因、豬傳染性胃腸炎病毒S基因、口蹄疫病毒3D基因，分別設計一對長探針和短探針(序列見表I )，同時設計一對PCR擴增的通用引物(序列見表2)。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴增的通用引物，一段是病毒特異性序列；長探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴增的通用引物和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列；且位于右側的探針5'端進行磷酸化處理。通過在上述5種病毒的長探針中加入不同長度的填充序列，然后通過病毒模板變性、探針雜交、連接及通用引物PCR擴增得到不同大小的PCR產物，通過毛細管電泳分析后實現對5種病毒的同時檢測。表I 豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒短探針和長探針名稱和序列
權利要求
1.用于同時檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的引物和多重連接探針，其特征在于，所述多重連接探針如序列表SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO : 10 所示，所述引物如序列表 SEQ ID ΝΟ:11 至 SEQ ID NO:12 所/Jn ο
2.根據權利要求I所述的引物和多重連接探針，其特征在于，所述序列SEQID ΝΟ1和SEQ ID NO 2分別為檢測豬流感病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 3和SEQID NO :4分別為檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO 6分別為檢測偽狂犬病病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 9和SEQ ID NO: 10分別為檢測口蹄疫病毒的短探針和長探針，其中，所述SEQ ID NO :2，SEQID NO :3，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8 和 SEQ IDNO 10 的 5’ 端進行磷酸化處理。
3.—種檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒，其包括以下組分 (1)MLPA緩沖液； (2)探針混合物，其包括如序列表SEQID NO: I至SEQ ID NO :10所示的用于檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的多重連接探針，其中，所述 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8 和 SEQID NO : 10的5’端進行磷酸化處理； (3)連接反應液，其包括Ligase-65緩沖液A和Ligase-65緩沖液B； (4)Ligase_65連接酶； (5)PCR反應液，其包括如序列表SEQ ID NO: 11至SEQ ID N0:12所示的引物； (6)SALSA聚合酶； (7)無RNA酶的滅菌純化水； (8)陰性對照； (9)陽性對照。
4.根據權利要求3所述的多重連接探針擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2分別為檢測豬流感病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4分別為檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的短探針和長探針；所述序列SEQID NO :5和SEQ ID NO :6分別為檢測偽狂犬病病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ IDNO :7和SEQ ID NO :8分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ IDNO 9和SEQ ID NO 10分別為檢測口蹄疫病毒的短探針和長探針。
全文摘要
本發明公開了一種用于同時檢測5種豬病病毒的多重連接探針擴增檢測試劑盒及引物和探針。所述多重連接探針如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO11至SEQ ID NO12所示。使用本發明所述的引物、探針，和/或包含該引物和探針的多重連接探針擴增檢測試劑盒可同時檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒5種重要豬病病原，節約了檢測時間和成本，有利于疫病的及時確診。
文檔編號C12Q1/70GK102943129SQ20121050596
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者馬貴平, 史喜菊, 喬彩霞, 郭志紅, 張偉 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局