專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及用于發酵生產d-核糖的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及用該菌發酵生產D-核糖的方法。
背景技術：
D-核糖是一種極重要的戊醛糖，是生物體內遺傳物質核酸的重要組成成分，也是生物體合成部分氨基酸、堿基等的重要中間代謝物，具有重要的生理功能。D-核糖最先被用于半合成法生產維生素B2。隨著D-核糖工業的發展及其應用研究的深入開展，其在食品工業和醫藥工業等方面的前景也逐漸被認識到，D-核糖可以作為生產原料合成核苷酸類風味增強劑，如5’-MP、5’-GMP等；在醫藥工業上，其作為合成抗病毒、抗癌藥物的原料藥的研究和應用也越來越廣泛。同時D-核糖作為存在于所有細胞中的天然成份，與腺苷酸的形成和ATP的再生有著密切的關系，是生命代謝最基本的能量來源之一，在心臟和骨骼肌代謝中起關鍵作用，能夠促進局部組織缺血、缺氧的恢復，在治療心肌局部缺血、防治因運動引起的肌肉酸痛和抗疲勞方面也具有良好作用?？傊?，D-核糖具有非常廣闊的應用前景。從十九世紀末人類鑒定出D-核糖以來，D-核糖的生產方法主要經歷了酶法水解RNA、以其他糖或有機酸為原料化學合成和利用微生物發酵生產三類。其中，酶法水解RNA分離D-核糖的方法過程繁雜、制造成本高、收率低，不適宜進行大規模生產；化學合成法生產過程中因會用到汞電極點解的工藝過程，易造成嚴重的環境污染。進入上世紀七十年代，人們開始以代謝控制發酵理論為指導，利用微生物營養缺陷型菌株進行發酵法生產D-核糖的研究。Sasajima在1971年的研究中發現了枯草芽孢桿菌轉酮酶缺陷型菌株在以12.5%葡萄糖為碳源時經過6天發酵，最終發酵液中D-核糖的積累量為35g/L ；1976年用改良后的枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株進行好氧發酵，D-核糖的積累量達到72.3g/L。1988年Kishimoto等用短小芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株，在添加芳香族氨基酸的培養基中，D-核糖的產量達92.1 g/L。1997年Wulf用短小芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株生產D-核糖，其產率為45 g/L。1997年江蘇微生物研究所鄧崇亮等選育的枯草芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株以葡萄糖為底物進行好氧發酵，D-核糖產量高達92 g/L。經過上述研究者們的研究發現枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株能大量積累D-核糖。另外，通過研究D-核糖生物合成及其相關代謝途徑可知，要使微生物大量積累D-核糖除了阻斷其下游代謝途徑的進行，還應當增加D-核糖前體物的合成，即增加葡萄糖脫氫酶的活力。葡萄糖脫氫酶是該生物合成途徑的調節酶，不可逆反應，其活力的大小決定了 D-核糖產量高低。在芽孢桿菌中，葡萄糖脫氫酶與芽孢的形成有關，在芽孢形成過程中被誘導產生。然而芽孢的形成會改變微生物體內酶的種類和數量，影響其正常代謝活動，不利于D-核糖的積累。從枯草芽孢桿菌中分離得到的D-核糖高產菌株，葡萄糖脫氫酶的合成不受抑制，能夠獨立存在于營養體細胞中，Sasajima的研究也印證這一點,他對D-核糖生產菌株進行反復誘變，在維持轉酮酶缺失的情況下，選育出一株葡萄糖脫氫酶活力高和芽孢生成能力喪失的突變株，D-核糖產量達70 g/L。上述的國內外報道中，通過選育枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株進行D-核糖發酵，在D-核糖的產量上達到一個較高的水平，但是還存在殘糖高、發酵液雜質多的缺點，不利于D-核糖的后續提??；發酵過程易生成芽孢，影響D-核糖的產量；發酵周期長，一般大于70小時。

發明內容
本發明的目的在于提供一種喪失芽孢生成能力、穩定高產D-核糖的枯草芽孢桿菌，及該菌種發酵生產D-核糖的方法，以克服現有技術殘糖高、易產生芽孢、發酵周期長的缺陷。本發明所提供的菌株為枯草芽孢桿菌BAV20120416，是以購自北京北納創聯生物技術研究院的一株可少量積累D-核糖的菌株ATCC21360為出發菌株，采用常規誘變方法，對ATCC21360進行紫外線、亞硝基胍等物理、化學誘變劑處理，經過多次反復誘變篩選培育出來的，能使最終發酵液殘糖降為O、其他雜質少，發酵過程不易產生芽孢，發酵周期短，且能穩定進行D-核糖工業化生產的菌株。本發明所述枯草芽抱桿 菌BAV20120416菌株，已于2012年4月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為=CGMCCN0.6013，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。一、枯草芽孢桿菌BAV20120416的獲得
以枯草芽孢桿菌ATCC21360為起始菌株，在斜面培養基上，32 38°C條件下培養f 2天，刮取菌體細胞于無菌生理鹽水，制成菌懸液，使細胞濃度為I X IO8IO9個/mL。按照常規誘變方法，用紫外燈、亞硝基胍等物理、化學誘變劑相間或連續處理。取上述菌懸液于培養皿中，置于15W紫外燈下，距離20cm，照射0.5飛分鐘；取上述菌懸液用lmg/mL的亞硝基胍處理液，32 38°C保溫震蕩3(Γ60分鐘，將亞硝基胍處理過的菌體離心，用生理鹽水沖洗幾遍，以去除殘留的亞硝基胍。將用紫外燈、亞硝基胍相間或連續處理過的菌液涂布于平板培養基上，32 38°C條件下培養廣2天，取單菌落分別點于基本培養基與補充培養基上，篩選在補充培養基上生長良好，而在基本培養基上不能生長的菌落，即枯草芽孢桿菌轉酮酶缺陷型菌株。將篩選的菌株經種子培養基和發酵培養基搖瓶發酵復篩和進一步分離篩選，選育出一株遺傳性質穩定、不易生芽孢、發酵周期短、高產D-核糖的菌株，即為保藏號為CGMCCN0.6013的枯草芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株上述枯草芽孢桿菌BAV20120416生物學特征:細胞大小0.7 0.8X 2 3微米，呈短桿狀，單生、成對或呈鏈狀排列，無莢膜，能運動，菌落圓形或不規則狀，菌落扁平、表面粗糙不透明、污白色或微黃色。生理生化特性:革蘭氏染色陽性，好氧，化能異養，液化明膠，胨化牛奶，還原硝酸鹽，接觸酶陽性，可同化糖類(葡萄糖、山梨醇、可溶性淀粉、甘露醇、果糖等)，可利用氮源(硫酸銨、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿等)，生長PH 5 8，生長溫度32 38。C。二、新菌種BAV20120416發酵生產D-核糖的方法
1、斜面培養
將上述誘變獲得的枯草芽孢桿菌轉酮酶缺陷突變株BAV20120416接種于斜面培養基，32 38°C培養天，制得斜面菌種。2、種子培養
取斜面菌種接種于種子培養基32 38°C搖床培養12 16h，制得發酵用種子菌液，OD值
1.2-1.5。3、發酵培養
按59TlO% (按體積％)的接種量將種子液接入預先準備好的發酵培養基中，32 38°C條件下進行發酵培養，發酵時間4(T60h，發酵液初始pH 6.5 7.2，發酵過程中通過流加酸堿使發酵液PH控制在5.6^7.0，發酵過程中定時取樣，觀察菌種生長狀態，測定發酵液中葡萄糖和D-核糖的濃度，當發酵液中葡萄糖濃度降到0，維持一段時間，D-核糖濃度不再上升時，發酵結束。上述斜面培養基組成(％):蛋白胨0.5 2.0，玉米漿0.5 1.0，酵母粉0.5 1.0，氯化鈉0.2 0.5，硫酸錳0.005 0.01，瓊脂1.2 2.0，調節pH 6.5 7.2。上述種子培養基組成(％):葡萄糖1.(T3.0，玉米漿0.5 1.0，磷酸氫二鉀0.2 0.5，磷酸二氫鉀0.05 0.2，硫酸錳0.0`05 0.02，調節pH 6.5 7.2。上述發酵培養基組成(％):葡萄糖12.(T20.0，玉米漿1.(T3.0，硫酸銨0.3^1.0，磷銨0.2 1.0，硫酸錳0.005 0.02，調節pH 6.5 7.2。上述發酵液中葡萄糖的測定方法:使用山東省科學院生物研究所生產的SBA-40D型生物傳感分析儀，通過固定化葡萄糖氧化酶膜專一的測定發酵液中葡萄糖含量。D-葡萄糖+H2O葡萄糖氧化酶D-葡萄糖酸+H2O2
上述D-核糖的測定方法:采用Dionex U3000液相色譜系統測定發酵液中D-核糖的含量，具體條件如下:
泵:Dionex U3000 Pump 柱:Kromasil 100-5NH2 (200 X 4.6mm)
流動相:乙腈:水=70:30 (V:V)
流速:1.0ml/mL 柱溫:40°C
檢測器:Shodex R1-101不差檢測器
本發明BAV20120416和親株ATCC21360發酵葡萄糖對比結果見表1:
權利要求
1.一種枯草芽抱桿菌iBaciIlussubtiIisy >d2QY2S)Al&菌株，已于2012年4月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為=CGMCC N0.6013。
2.一種應用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌UaciBy1S1SMdVi1S)BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于通過斜面培養、種子培養和發酵培養，生產D-核糖。
3.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于斜面培養基組成％為:蛋白胨0.5 2.0，玉米漿0.5 1.0，酵母粉0.5 1.0，氯化鈉0.2 0.5，硫酸錳0.005 0.01，瓊脂1.2 2.0，調節pH 6.5 7.2。
4.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于種子培養基組成％為:葡萄糖l.(T3.0，玉米漿0.5 1.0，磷酸氫二鉀0.2、.5，磷酸二氫鉀0.05 0.2，硫酸錳0.005 0.02，調節pH 6.5 7.2。
5.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于發酵培養基組成％為:葡萄糖12.(T20.0，玉米漿l.(T3.0，硫酸銨0.3 1.0，磷銨0.2 1.0，硫酸錳 0.005 0.02，調節 pH 6.5 7.2。
6.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于所述的斜面培養的操作條件為:將枯草芽孢桿菌株BAV20120416接種于斜面培養基，32 38°C培養廣2天，制得斜面菌種。
7.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌BAV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于所述的種子培養的操作條件為:取斜面菌種接種于種子培養基32 38°C搖床培養12 16h，制得發酵用種子菌液 如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌B`AV20120416發酵生產D-核糖的方法，其特征在于所述的發酵培養的操作條件為:按5 10體積％的接種量將種子液接入預先準備好的發酵培養基中，32 38°C條件下進行發酵培養，發酵時間4(T60h，發酵液初始pH 6.5 7.2，發酵過程中通過流加酸堿使發酵液pH控制在5.6^7.0，發酵過程中定時取樣，觀察菌種生長狀態，測定發酵液中葡萄糖和D-核糖的濃度，當發酵液中葡萄糖濃度降到0，維持一段時間，D-核糖濃度不再上升時，發酵結束。
全文摘要
本發明為一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BAV20120416菌株及用其發酵生產D-核糖的方法，該菌株已于2012年4月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNO.6013。該菌株是枯草芽孢桿菌轉酮酶缺失突變株，具有遺傳穩定性好、不易產芽孢等特點；能夠在以葡萄糖、玉米漿為主要原料的發酵培養基中積累90g/L以上D-核糖，約為其親株枯草芽孢桿菌ATCC21360的三倍，發酵周期短，一般控制在50小時左右，低于現有技術約1/3，特別是雜質少，最終發酵液殘糖降為0，特別適用于醫藥生產要求。
文檔編號C12N1/20GK103146595SQ201210505600
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者蔡會英 申請人:山東邦奧創業生物科技有限公司