專利名稱：一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組dna提取方法
技術領域：
:本發明涉及一種基因組DNA提取方法，具體為一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法。
背景技術：
:冬蟲夏草是一種名貴中藥材，有軟黃金之稱，資源有待深加工開發。目前，已有大量冬蟲夏草粉碎加工的產品問世，但尚沒有專門針對冬蟲夏草原草粉進行DNA提取的方法，給多重PCR和熒光定量PCR等分子分析鑒定研究帶來困難。冬蟲夏草子座，蟲體質地韌性存在差異，DNA提取過程中如果研磨過度易引起蟲體部位DNA斷裂損失，研磨不徹底又會導致子座DNA難以溶出，目前，針對冬蟲夏草原草以及發酵菌絲體基因組DNA的提取，報道的主要有氯化芐法和CTAB法等化學方法以及蛋白酶K法。化學方法由于未添加蛋白酶K處理，往往純度不夠，含有較多雜蛋白；而蛋白酶K法提取過程溫和，DNA濃度難以保證。以上方法均難以滿足提取高純度的冬蟲夏草原草粉基因組DNA的要求。因此，建立一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法已成為目前亟需解決的問題
發明內容
: 本發明的目的是提供一種能夠專門從冬蟲夏草原草粉中提取高質量高純度基因組DNA的方法，為之后的分子生物學分析提供優質的模板。為達到上述目的，本發明根據冬蟲夏草原草粉的特點，摸索出了一套保護各組織基因組DNA完整性的重復過篩-研磨的處理方法。并組合了 DNA純化試劑盒進行提取，達到高純的要求。具體操作步驟如下:(I)取冬蟲夏草原草粉0.25g,置于無菌的研缽中；(2)加入液氮在IOs以內迅速研磨至粉末；(3)將研磨后的粉末過120目篩；(4)將過篩后的粉末轉移到1.5ml的離心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴鍋中65 °C恒溫處理30min ；裂解液組成為:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、IOOmM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0、1.4M NaCl (氯化鈉)、20mM EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、1.5%polyvinyl-pyrrolidone, PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、0.5 2-mercaptoethanol ( ^ 疏基乙醇)；(5)在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戊醇(24: l)，13000rpm，離心IOmin ；(6)取上清液，加入RNA酶至終濃度為60 u g/ml，37°C保溫30min ；(7)加入蛋白酶K至終濃度為1201^/1111，371:保溫301^11;(8)重復步驟⑶；
(9)取上清液，加入0.8倍體積的異丙醇；(10)4°C放置 15min 后，13000rpm 離心 2min ；(11)去上清液，加入70%預冷乙醇500iil洗滌脫鹽，13000rpm，離心2min，重復2次；(12)采用OMEGA公司生產的DNA純化試劑盒進行DNA純化。本發明采用液氮快速研磨的方法，減少了 DNA碎片的產生，同時研磨后得到的粉末經120目篩過濾，避免了研磨過度易引起蟲體部位DNA斷裂損失，研磨不徹底又會導致子座DNA難以溶出的問題，提取過程中加入RNA酶，以消除RNA對提取產物的干擾。本發明不需要進行繁瑣的化學提取前處理操作。獲得的基因組片段大約為21kb ；濃度可達 450 800ng/ u L, A260/A280 為 1.833 1.898，A260/A230 為 2.043 2.126。可滿足多重PCR，RT-PCR等分子分析鑒定研究的需要。


:附圖是利用I %濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測本發明方法提取得到的冬蟲夏草原草粉基因組DNA樣品。M-入DNA/HindIII Marker，1/2/3為3個重復。
具體實施方式
:下面的實施方式是為了進一步闡述本發明，從而使本領域技術人員更全面地理解本發明，而不會給本發明造成任何限制。冬蟲夏草原草粉取自 青海三江源藥業有限公司。實施例1取冬蟲夏草原草粉0.25g,置于無菌的研缽中；加入液氮在IOs以內迅速研磨至粉末；將研磨后的粉末過120目篩；將過篩后的粉末轉移到1.5ml的離心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴鍋中65°C恒溫處理30min(裂解液組成為:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、100mM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH 8.0、1.4MNaCl (氯化鈉)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、
0.5% 2-mercaptoethanol 巰基乙醇))；在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戍醇(24: 1)，13000印111，離心101^11;取上清液，加入1 應酶至終濃度為601^/1111，371:保溫30min ;加入蛋白酶K至終濃度為120 y g/ml，37°C保溫30min ;重復步驟￠);取上清液，加入0.8倍體積的異丙醇沉淀DNA，13000rpm,離心2min ;加入70%預冷乙醇500 U I洗滌脫鹽，13000rpm,離心2min，重復2次；采用OMEGA公司生產的DNA純化試劑盒進行DNA純化。50 u I無菌雙蒸水或TE洗脫得到高純度高質量原草粉基因組DNA(大約為20Kb)，置于-20°C冰箱中保存。利用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測本發明方法提取得到的冬蟲夏草原草粉基因組DNA(詳見說明書附圖)，采用DU-800分光光度計進行檢測，三個平行平均濃度為 652ng/u L, A260/A280 = 1.854，A260/A 230 = 2.014。
權利要求
1.一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法，依次包括如下步驟: (1)取冬蟲夏草原草粉，置于無菌的研缽中； (2)加入液氮迅速研磨至粉末； (3)將研磨后的粉末過篩； (4)將過篩后的粉末轉移到1.5ml的離心管中，加入裂解液進行裂解處理； (5)在裂解處理后的樣品中加入等體積的氯仿異戊醇(24: I)，離心抽提； (6)取上清液，加入RNA酶處理； (7)加入蛋白酶K處理； (8)重復步驟(6)； (9)取上清液，異丙醇沉淀DNA； (10)70%預冷乙醇洗滌脫鹽2次； (11)純化DNA。
2.如權利要求1的方法，其中步驟(I)取0.25g原草粉。
3.如權利要 求1的方法，其中步驟⑵液氮研磨的時間控制在IOs以內。
4.如權利要求1的方法，其中步驟(3)將研磨后的粉末過120目篩。
5.如權利要求1的方法，其中步驟(4)加入裂解液組成為:2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、100mM Tris-HCl(三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)pH8.0、1.4M NaCl (氯化鈉)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯燒酮)、0.5% 2-mercaptoethanol (P 疏基乙醇)。
6.如權利要求1的方法，其中步驟(4)加入裂解液700yl，并置于水浴鍋中65°C恒溫處理30min。
7.如權利要求1的方法，其中步驟(5)離心轉速為13000rpm,離心時間為lOmin。
8.如權利要求1的方法，其中步驟(6)加入的RNA酶終濃度為60ii g/ml，處理條件為37°C，30min。
9.如權利要求1的方法，其中步驟(7)加入的蛋白酶K終濃度為120ii g/ml。處理條件為 37°C，30min。
10.如權利要求1的方法，其中步驟(9)中加入的異丙醇體積為上清液體積的0.8倍，4°C 沉淀 15min 后，13000rpm 離心 2min。
11.如權利要求1的方法,其中步驟(10)中加入的70%預冷乙醇體積為500ii I。
12.如權利要求1的方法，其中步驟(11)中采用OMEGA公司生產的DNA純化試劑盒進行純化。
全文摘要
本發明公開了一種冬蟲夏草原草粉的高純基因組DNA提取方法。將冬蟲夏草原草粉用液氮迅速研磨后，過120目篩，采用CTAB抽提，RNA酶和蛋白酶K處理后，結合純化試劑盒成功提取到高純的基因組DNA。所提DNA經DU-800分光光度計檢測濃度可達450～800ng/μL，A260/A280為1.833～1.898，A260/A230為2.043～2.126，適用于后期的多重PCR，RT-PCR的研究。
文檔編號C12R1/645GK103232995SQ20121050667
公開日2013年8月7日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者程池, 扎西才吉, 李輝, 姚粟, 劉洋, 張欣, 白飛榮 申請人:中國食品發酵工業研究院, 玉樹藏族自治州三江源藥業有限公司