轉基因構建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及轉基因構建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應用。具體地，發明人發現長度為1.8kb的Lcn5基因啟動子序列能驅動外源基因在小鼠附睪頭部（特別是中遠端特定）區域表達，并由此構建了由該啟動子驅動的外源Cre基因表達載體。這種轉基因載體能驅動外源Cre基因在動物附睪頭部特異地表達，也可以驅動其他基因如CreERT2重組酶等的表達。應用這種轉基因體系制備轉基因小鼠，能獲得很高的基因組整合率（>25%），并可準確、高效驅動外源基因在附睪頭部中遠端區域表達。本發明還建立了附睪頭部特定區域條件性基因敲除或過表達技術平臺。
【專利說明】轉基因構建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，具體地，本發明涉及一種轉基因構建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應用，特別是建立了附睪頭部特定區域條件性基因敲除或過表達技術平臺。
【背景技術】
[0002]將外源基因導入動物機體或深入探討基因功能需借助轉基因技術，特別地，探討基因在動物機體的功能或改良動物性狀，建立新品系等，以及研究附辜中的基因對附辜發育或精子成熟的功能，需要采用轉基因過表達或基因敲除技術。這些技術一方面需要轉基因打靶載體；另一方面為了實現控制基因在特定組織或細胞表達，需要組織特異性啟動子。
[0003]啟動子是一段特定的直接與RNA聚合酶及轉錄因子相結合、決定基因轉錄起始與否的DNA序列。因此篩選和構建由組織特性啟動子驅動的外源蛋白的轉基因載體具有非常重要的意義。
[0004]傳統的基因敲除(knock out)技術是直接破壞胚胎干細胞(ES)中的靶基因而使之失活，打靶后該基因將在所有組織中失活，如果該基因對胚胎發育必需則會造成胚胎致死，這樣就難以研究其在出生后或成年時的功能。針對此缺陷，條件性基因敲除(Conditionalknock out)技術應運而生。條件性基因敲除主要利用了 Cre/LoxP為代表的重組酶系統，通過組織特異性啟動子或四環素/類固醇激素受體調控系統控制Cre的表達，使LoxP化的靶基因被敲除，因而避免了傳統基因敲除方法引起的胚胎致死和復雜表型的缺陷，成為后基因組時代在體內研究基因功能的首選技術。建立組織特異性基因剔除小鼠的方法是首先通過同源重組建立靶基因“floxed”小鼠和通過受精卵原核注射建立組織特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠。
[0005]目前還沒有附睪頭部特異表達Cre重組酶的轉基因小鼠，因此本領域迫切需要篩選和開發該種工具小鼠。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供一種轉基因構建物及在制備附睪頭部特異表達Cre重組酶轉基因小鼠中的應用。
[0007]本發明的另一目的是建立附睪頭部特定區域條件性基因敲除或過表達技術平臺。
[0008]在本發明的第一方面，提供了一種轉基因構建物，所述的構建物包括外源Cre基因以及與外源Cre基因可操作連接的啟動子元件；其中，所述的啟動子元件是脂質運載蛋白5 (Lip0calin5)的啟動子或其活性片段，并且所述啟動子具有驅動外源Cre基因在動物附睪頭部特異表達的功能。
[0009]在另一優選例中，所述的啟動子具有驅動外源Cre基因在動物附睪頭部中遠端特異表達的功能。[0010]在另一優選例中，所述的動物為哺乳動物，較佳地為人、鼠、牛、羊、豬等。
[0011]在另一優選例中，所述的啟動子元件選自下組:核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列與SEQ ID N0.:1所不序列的同源性≥95% (較佳地≥98%),且具有驅動外源基因在動物附睪頭部中特異表達的功能的多核苷酸；(c)如SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸，且具有驅動外源基因在動物附睪頭部特異表達功能的多核苷酸。
[0012]在另一優選例中,所述啟動子元件來源于動物的脂質運載蛋白5 (Lipocalin5)基因。
[0013]在另一優選例中，所述啟動子元件的序列如SEQ ID N0.:1所示。
[0014]在另一優選例中，所述的轉基因構建物還可以包括選自下組的任一基因或其組合:抗性基因、篩選標記基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、miRNA基因、生物制劑基因、或動物品質相關基因。
[0015]在另一優選例中，所述的篩選標記基因選自下組:gus(i3-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(綠色熒光蛋白)基因、DsRed (紅色熒光蛋白)基因。
[0016]在另一優選例中，所述的外源Cre基因具有如SEQ ID N0.: 2所示的核苷酸序列。
[0017]在本發明的第二方面，提供了一種基因表達盒，所述基因表達盒從5’至3’依次具有下述元件:啟動子元件、Cre基因的ORF序列、和終止子序列，并且所述的啟動子元件是脂質運載蛋白5 (Lip0calin5)的啟動子或其活性片段，所述啟動子具有驅動Cre基因在動物附睪頭部特異表達的功能。
[0018]在另一優選例中，所述的基因表達盒還包括選自下組的一種或多種元件:poly(A)元件、增強子、轉運元件、或基因靶向元件。
[0019]在本發明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有或第一方面所述的轉基因構建物，或第二方面所述的基因表達盒。
[0020]在另一優選例中，所述載體選自:細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、或動物細胞載體、穿梭載體。
[0021]在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有第三方面所述的載體、或其染色體整合有第一方面所述的轉基因構建物、或其染色體整合有第二方面所述的基因表達盒。
[0022]在另一優選例中，所述宿主細胞的染色體整合有一個或多個(如1-50個，較佳地
2-6個)拷貝的第一方面所述的轉基因構建物或第二方面所述的基因表達盒。
[0023]在另一優選例中，所述的宿主細胞選自下組:原核細胞(如大腸桿菌、鏈霉菌屬、或農桿菌)、低等真核細胞(如酵母細胞)、或高等真核細胞(如動物細胞)。
[0024]在另一優選例中，所述的宿主細胞為小鼠細胞。
[0025]在本發明的第五方面，提供了第一方面所述的轉基因構建物、或第二方面所述的基因表達盒的用途，用于特異性調控外源Cre基因在動物附睪頭部特異表達。
[0026]在另一優選例中，用于特異性調控外源Cre基因在動物附睪頭部中遠端特異表達。
[0027]在本發明的第六方面，提供了一種制備轉基因動物的方法，包括步驟:[0028](a)提供轉基因的動物細胞，所述動物細胞含有第三方面所述的載體、或其染色體整合有第一方面所述的轉基因構建物、或其染色體整合有第二方面所述的基因表達盒；
[0029](b)將步驟(a)所述的轉基因的細胞再生為動物，從而獲得轉基因動物。
[0030]在另一優選例中，步驟(b)所述動物的染色體整合有第一方面所述的轉基因構建物、或第二方面所述的基因表達盒。
[0031]在本發明的第七方面，提供了一種轉基因動物的用途，所述的轉基因動物是用第六方面所述的方法制備的，所述的轉基因動物用于小鼠附睪頭部區域特異敲除或過表達目標靶基因。
[0032]在本發明的第八方面，提供了一種在動物附睪頭部特異性表達外源Cre基因的方法，包括步驟:
[0033](a)提供第一方面所述的轉基因構建物；
[0034](b)將步驟(a)中的轉基因構建物導入動物細胞，獲得轉化的動物細胞；
[0035](c)將步驟(b)中轉化的動物細胞再生成動物，從而使外源Cre基因在動物附睪頭部特異性表達。
[0036]在另一優選例 中，步驟(b)中所述轉化的動物細胞的染色體整合有第一方面所述的轉基因構建物。
[0037]在另一優選例中，所述的方法是一種在動物附睪頭部中遠端特異表達外源Cre基因的方法。
[0038]在本發明的第九方面，提供了一種在動物附睪頭部區域特異敲除目標靶基因的方法，包括步驟:
[0039](I)提供第一方面所述的轉基因構建物；
[0040](2)用步驟(1)的轉基因構建物轉化動物細胞，獲得轉化的動物細胞；
[0041](3)將步驟(2)中轉化的動物細胞再生成動物，從而使外源Cre基因在動物附睪頭部特異性表達；
[0042](4)將步驟(3)中獲得的轉基因動物與floxed化的轉基因動物交配，從而可獲得特異敲除目標基因的子代動物。
[0043]在另一優選例中，所述的floxed化的轉基因動物是具有Loxp位點的轉基因動物。
[0044]在另一優選例中，所述的動物為小鼠。
[0045]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0047]圖1顯示了 Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠制備技術路線。
[0048]圖2顯示附睪頭部特異基因啟動子驅動Cre重組酶轉基因過表達載體構建和體外活性驗證；(a)Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體示意圖，骨架為pUBC轉基因過表達載體，1.8kb啟動子序列來自在附睪頭部中遠端主細胞表達的Lcn5基因；(b)Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體能在HEK 293T細胞上表達Cre重組酶mRNA，Lcn5基因受雄激素調控，需共轉AR過表達載體并補充雄激素，NTC為非模板對照，AR，雄激素受體表達載體，pCAG-Cre為陽性對照；
(c)Lcn5 (1.8) -Cre轉基因載體能驅動活性Cre重組酶表達，UBb-DsRechemGFP為Cre重組酶活性報告載體，RFP位于兩個1xP位點之間，GFP位于第二個1xP之后，當有活性Cre重組酶表達時，紅色熒光減弱或消失，綠色熒光開始表達。
[0049]圖3顯示轉基因首建鼠鑒定和建系，通過原核顯微注射技術共出生38只首建鼠，通過PCR技術鑒定其中有11只轉基因陽性鼠，WT為野生型小鼠。
[0050]圖4顯示Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠Cre重組酶mRNA的時空表達譜；(a) Lcn5(1.8 )-Cre轉基因小鼠在附睪頭部特異表達Cre重組酶mRNA; (b) (c)Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠Cre重組酶mRNA在出生后30天的附睪頭部開始表達，50-60天表達量達到最高，繼而有所下降，NTC為非模板對照，TG為轉基因小鼠，WT為野生型小鼠。
[0051]圖5顯示Cre重組酶在體內組織特異性和發育時間表達活性；(a)Lcn5( 1.8)-Cre轉基因小鼠與Cre重組酶活性報告基因轉基因小鼠mT/mG交配，檢測子代雙轉基因小鼠GFP表達，GFP僅僅在附睪頭部表達，在其它組織無GFP信號，表明Lcn5 (1.8)_Cre轉基因小鼠Cre重組酶在該特定區域表達并具有切割活性；(b)檢測不同發育時間點子代雙轉基因小鼠發現GFP在附睪頭部亮度增加，顯示Cre表達隨發育時間增加而升高，活性加強。
[0052]圖6顯示Cre重組酶在組織和亞細胞中的定位:Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠與Cre重組酶活性報告基因小鼠mT/mG交配，檢測子代雙轉基因小鼠紅色熒光和綠色熒光表達，發現有綠色熒光表達表示有活性Cre重組酶存在；(a)、(b) Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠在附睪頭部中遠端表達活性Cre重組酶；(c)Lcn5 (1.8)_Cre轉基因小鼠在附睪頭部主細胞表達活性Cre重組酶，AQP 9為主細胞marker。
[0053]圖7顯示Cre重組酶活性的時空特性；Aip Ifim轉基因小鼠作為測試Lcn5·(1.8)-Cre轉基因小鼠的報告基因小鼠，Lcn5 (1.8) -Cre與Aiplfim轉基因小鼠交配，檢測子代雙轉基因小鼠Lcn5 (1.8) -Cre;AipIfimCre重組酶切割后的目的片段；(a) Aiplfl7fl轉基因小鼠基因組1xP位點示意圖；(b) (c) Cre重組酶在30天開始表達，在附睪頭部區域能切割目標基因；WT表示野生型；Aipl-K0表示在附睪頭部條件性敲除Aipl基因。
[0054]圖8顯示Lcn5 (5.2) -Cre轉基因過表達載體的表達特性，圖8a顯示其結構；圖8b顯示了來自不同line的Lcn5 (5.2) -Cre轉基因小鼠Cre的組織表達特性，
[0055]圖9顯示CreERT2在附睪頭部中遠端區域表達。CreERT2同樣由1.8kb的Lcn5啟動子驅動。Lcn5(l.8) -CreERT2轉基因小鼠制備流程同Lcn5(l.8)-Cre0
【具體實施方式】
[0056]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立了一種能夠在附睪頭部特異表達外源蛋白的轉基因體系。具體地，發明人發現，具有1.8kb的Lcn5基因啟動子能驅動外源蛋白在附睪頭部的特異表達，并由此構建了由附睪頭部特異基因啟動子驅動的外源蛋白轉基因過表達載體。這種載體能驅動多種外源蛋白，如具有識別基因組上1xp位點并行使切割活性的Cre和CreERT2重組酶等，將這種轉基因載體制備轉基因小鼠，轉化率和整合率高達25%以上，能準確、高效驅動外源基因在附睪頭部特定區域表達，在此基礎上完成了本發明。
[0057]術語[0058]如本文所用，術語“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種準確有效起始基因轉錄功能的核酸序列，引導基因核酸序列轉錄為mRNA，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，一般地，啟動子或啟動子區域提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。
[0059]如本文所用，術語“本發明啟動子”、“附睪頭部特異表達的啟動子”、“附睪頭部中遠端特異表達的啟動子Lcn5”或“附睪頭部特異表達的啟動子Lcn5 (1.8)”可互換使用，指鼠源性(較佳地來自于小鼠)Lcn5基因的啟動子元件，本發明一種典型的啟動子Lcn5序列如 SEQ ID N0.:1 所示。
[0060]如本文所用，術語“動物”沒有特別的限制，包括(但不限于):大鼠、小鼠、家兔、羊、牛等，較佳地為小鼠。
[0061]在本文中，所述啟動子或啟動子區(域)包括啟動子的變體，啟動子變體可以通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0062]本發明還包括與本發明的優選啟動子序列(SEQ ID N0.:1)具有50%或以上(優選60%以上，70%以上，80%以上，更優選90%以上，更優選95%以上，最優選98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有特異性調控啟動附睪組織表達的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列相似性或同一性)。
[0063]應理解，盡管本發明的實例中提供了來源于小鼠的啟動子Lcn5，但是來源于其它類似的物種(尤其是屬于同一科或屬的動物)的、與本發明啟動子具有一定同源性(保守性)的啟動子，也包括在本發明的范圍內，只要本領域技術人員在閱讀了本申請后根據本申請提供的信息可以方便地分離得到該啟動子。
[0064]如本文所用，術語“特異性表達”是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織的表達。所述的“附睪頭部中遠端組織特異性的表達”是指在本發明的啟動子調控下，目的基因高度特異性和專一性地在附睪頭部中遠端組織中表達。
[0065]如本文所用，“外源的”或“異源的”是指不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。
[0066]如本文所用，“順式調控元件”是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守性堿基序列。
[0067]本發明的啟動子可以被可操作地與外源基因連接，該外源基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。本發明所述的外源基因(也稱為目的基因)沒有特別的限制，可以為miRNA基因或編碼具有特定功能蛋白的基因，例如某些在農業或動物改良上具有重要特性或功能的蛋白。
[0068]所述外源基因的代表性例子包括(但不限于):抗性基因、篩選標記基因、抗原蛋白基因及生物制劑基因、或動物品質相關基因。 [0069]所述的抗性基因選自下組:抗病毒基因、抗生素抗性基因、耐高溫基因等。
[0070]所述的篩選標記基因選自下組:gus(i3-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo (新霉素)基因、或gfp (綠色熒光蛋白)基因。
[0071]所述的抗原蛋白基因及生物制劑基因選自下組:細菌類抗原蛋白(如霍亂毒素B，破傷風毒素等)、病毒類抗原蛋白(如犬細小病毒)、原生動物類抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB - pins)、或生物制劑(如a 2b干擾素,胰島素樣生長因子等)。
[0072]所述的動物品質相關基因選自下組:氣基酸改良相關基因、脂肪改良相關基因或雄性不育相關基因。
[0073]本發明優選的外源基因為Cre基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0074]轉基因構建物
[0075]本發明提供了一種轉基因構建物，所述的構建物包括外源Cre基因以及與外源Cre基因可操作連接的啟動子元件；所述的啟動子元件是脂質運載蛋白5 (Lipocalin5)的啟動子或其活性片段，并且所述啟動子具有驅動外源Cre基因在小鼠附睪頭部特異表達的功能。
[0076]所述的啟動子優選具有驅動外源Cre基因在動物附睪頭部中遠端特異表達的功能。所述的動物為哺乳動物，較佳地為人、鼠、牛、羊、豬等。
[0077]本發明所述的啟動子選自下組:核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多核苷酸；核苷酸序列與SEQ ID N0.:1所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%)，且具有驅動外源基因在動物附睪頭部中特異表達的功能的多核苷酸；如SEQ ID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸，且具有驅動外源基因在動物附睪頭部特異表達功能的多核苷酸。
[0078]本發明所述的外源Cre基因具有如SEQ ID N0.: 2所示的核苷酸序列。
[0079]基因表達盒，載體
[0080]本發明還提供了一種基因表達盒，所述表達盒從5’ -3’依次具有下列元件:啟動子、外源基因ORF序列和終止子。優選地，所述啟動子序列如SEQ ID N0.:1所示或與SEQID N0.:1所示。優選地,所述表達盒包括增強子等元件。
[0081]本發明還提供了一種包括本發明基因表達盒的重組載體，優選轉基因載體為Lcn5 (1.8)-Cre,其核苷酸序列如SEQ ID N0.: 3所示，具體見序列表。
[0082]作為一種優選的方式，重組載體的啟動子下游包含多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點內，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。作為另一種優選方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向):啟動子，目的基因和終止子。如果需要，所述的重組載體還可以包括選自下組的元件:3’多聚核苷酸化信號；非翻譯核酸序列；轉運和靶向核酸序列；抗性選擇標記(二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白等)；增強子；或操作子。
[0083]用于制備重組載體的方法是本領域普通技術人員所熟知的。表達載體可以是細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要其能夠在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都是可以被米用的。
[0084]本領域普通技術人員可以使用熟知的方法構建含有本發明所述的Lcn5 (1.8)啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。
[0085]本發明的啟動子、轉基因構建物、表達盒或載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使宿主表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌:或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如動物細胞。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物(如大腸桿菌)時，可以用CaCl2法處理，也可用電穿孔法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法(如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等)。
[0086]在本發明的一個具體實例中，在1.8kb Lcn5啟動子的啟動或指導下，可以使Cre基因特異地在動物附睪組織，特別是附睪頭部中表達，特別優選在附睪頭部的中遠端表達，而其他部分沒有任何表達。
[0087]在本發明的一個具體的實施例中，為了獲得在附睪頭部特異表達Cre重組酶的轉基因小鼠模型，可以采取了如下技術路線(圖1):
[0088]構建Lcn5 (1.8) -Cre轉基因表達載體；在細胞水平測試轉基因表達載體的體外活性；原核顯微注射；第一代首建轉基因陽性小鼠鑒定和建系；RT-PCR檢測F2代小鼠Cre重組酶mRNA的時空表達特性；與Cre重組酶報告基因小鼠(mT/mG)和floxed化的轉基因小鼠(Aiplfim)交配，確定體內Cre重組酶表達的組織特異性和切割活性。
[0089]鑒于此，本發明首先通過轉基因技術獲得子代小鼠38只，經過基因型鑒定，11只小鼠在其基因組上整合有Cre基因，整合率為28.9%。通過RT-PCR方法檢測Cre組織表達分布，發現其mRNA僅在附睪頭部特異表達，與內源性Lcn5基因表達模式一致。將Lcn5(1.8) -Cre轉基因小鼠Cre重組酶活性報告熒光轉基因小鼠mT/mG交配，發現子代雙轉基因小鼠GFP僅在附睪頭部中遠端區段特異表達，顯示Cre重組酶在附睪特定區域表達并具有切割活性，并隨發育時間表達增加。為了進一步驗證Cre重組酶在體內的切割活性，將Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠與floxed化的Aipl條件性基因打靶小鼠交配，Lcn5(1.8) -Cre;AipIfwflox小鼠的多個組織的基因組DNA的PCR結果顯示，Cre重組酶能特異性在附睪頭部成功介導Loxp位點的重組。本研究成功獲得到了一個附睪頭部特異表達Cre重組酶的轉基因小鼠新品系。
[0090]附睪頭部特定區 域條件性基因敲除或過表達技術平臺
[0091]本發明還提供了一種附睪頭部特定區域條件性基因敲除或過表達技術平臺及其建立方法。如本發明背景部分所述，附睪是精子成熟與儲存的場所，研究附睪中基因表達與調控有助于了解精子成熟與儲存的分子機制。基因敲除技術是目前研究特定基因功能最直接的方法，傳統的基因敲除技術可能造成胚胎致死。目前由組織或細胞特異性基因啟動子驅動Cre重組酶表達的轉基因小鼠模型有上百種之多，但是還未見到有附睪頭部組織特異性表達Cre或CreERT2重組酶轉基因小鼠模型的報道。
[0092]為了對目的基因在附睪中實現特定時間或區域特異性敲除，在本發明的具體實施例中，發明人成功構建了由附睪頭部特異基因啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠模型。其與Aipl轉基因小鼠交配后，篩選雙轉基因陽性小鼠，檢測發現可在附睪頭部特異敲除Aipl基因，由此建立了基于Cre-Loxp重組酶系統研究附睪頭部基因功能的技術平臺。
[0093]因此，本發明建立的附睪頭部特異表達Cre重組酶轉基因小鼠可以作為工具小鼠，實現在附睪頭部特異敲除或過表達目標基因，以研究其在附睪頭部缺失或過表達后對精子在附睪中精子成熟的作用，為探討雄性不育或避孕的分子機制提供新的技術手段。
[0094]驅動其它蛋白編碼基因或miRNA過表達情況
[0095]由上述實施例的結果可知，1.8kb片段長度的Lcn5基因啟動能準確，高效驅動外源基因在附睪特定區域表達活性蛋白，由此證明發明人構建的轉基因載體及生產轉基因動物的方法是穩定可靠和有效的，特別是篩選并確定了附睪頭部特異基因特定長度啟動子所具有的驅動外源基因在動物體內高效表達的能力。這為采用該轉基因體系驅動其它蛋白編碼基因在附睪頭部表達提供了新的途徑，因此可利用該轉基因載體，構建滿足不同需求的轉基因動物，如在生殖道可以起抗菌作用的抗菌肽或促進精子成熟的相關基因等。
[0096]已知miRNA為一類新類型的非編碼RNA，參與多種生物學進程。另外研究表明大多數miRNA的轉錄是受II型聚合酶驅動的，因此本發明也可利用Lcn5基因啟動子驅動miRNA在附睪頭部過表達，以探討其在體內的作用。優選的辦法就是找到合適的酶切位點，克隆其它編碼蛋白基因的CDS序列或miRNA的初級轉錄本序列，插入到轉基因載體1.8kb Lcn5啟動子之后，替換掉Cre重組酶基因，即可實現獲得目標轉基因過表達載體的目的。
[0097]founder, line
[0098]如本文所用，術語“founder”是指通過原核注射的方法得到的第一代轉基因小鼠，也稱為首建鼠。由于構建中存在一定幾率的隨機性，每一只founder都是不一樣的，以每一只founder起源的品系稱為line (品系),不同的line之間的表達可能會有差異。
[0099]對于普通的轉基因，表達的區域將取決于啟動子。如果選擇全身表達的啟動子，如Rosa26, CAG等，將得到全身表達的轉基因小鼠；如果選擇一些組織特異性表達的基因的啟動子，將得到組織特異性表達的轉基因小鼠，如本發明在Lcn5基因的啟動子下進行表達，會得到附睪頭部特異表達的轉基因小鼠。
[0100]轉基因小鼠品系建立情況說明 [0101]1.轉基因小鼠遺傳背景:制備的Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠遺傳背景是129品系，然后與C57B6回交一代。
[0102]2.陽性founder小鼠傳代和數量:Lcn5(l.8)-Cre轉基因小鼠成功鑒定了一個附睪特異表達Cre重組酶的轉基因小鼠，目前已成功得到第3代小鼠，來自1043#founder的目標轉基因小鼠生有14只雄鼠，10只雌鼠，其中轉基因陽性小鼠為7雄3母。其它非目標轉基因小鼠品系未作計算。
[0103]3.保種方法:
[0104]I)轉基因小鼠與C57B6遺傳背景小鼠回交純化；
[0105]2)分別將一對雌雄轉基因小鼠進行胚胎冷凍保存。
[0106]本發明的主要優點如下:
[0107](I)在本發明所述的附睪頭部特異表達外源Cre重組酶的轉基因體系中，所用啟動子能驅動外源基因在附睪頭部中遠端主細胞特異表達，而在全身其它組織不會有任何表達；
[0108](2)本發明的轉基因載體所用啟動子啟動效率很高，且專一性極強；
[0109](3)在本發明所論述的附睪頭部特異表達外源蛋白的轉基因體系具體應用中，由啟動子驅動的外源Cre重組酶在附睪出生后30d開始表達，其表達活性隨發育而增強，40-50d表達達到最高，如與foxp化的目標基因轉基因小鼠配合使用，即能在附睪頭部特定區域敲除或過表達目標基因，進而可探討目標基因對精子成熟的作用。
[0110]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York: ColdSpring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0111]實施例1
[0112]構建Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體以及體外活性驗證
[0113]1.附睪頭部特異啟動子驅動的Cre重組酶轉基因載體所用的骨架載體為常規市售的pUBC轉基因載體
[0114]首先對pUBC載體進行改造，利用Mlu I和Avr II雙酶切，切割下167bp的UBC啟動子序列，并將Avr II酶切位點置換為Kpn I。
[0115]以pBLCAT_5m-RABP 質粒(Lareyre, Thomas et al.1999)為模板，通過引物對:1cn5-pro-S:5’ ACGACGCGTCTACCTGGCCTCTCCTGCTCCT-3’ (SEQ ID NO:6)和 lcn5-pro_A:5，￡GTGGTACCTGGGTTCAGCTCCCCACCAG 3’ (SEQ ID NO:7)進行 PCR 反應，該引物擴增 1.8kb 的Lcn5 (1.8)-Cre啟動子序列，該1.8kb序列的全長如SEQ ID NO:1所示。分別用Mlu I和Kpn I限制性內切酶對PCR產物和pUBC轉基因載體進行雙酶切，通過T4DNA連接酶連接并測序鑒定。
[0116]同時用Not I和EcoR I限制性內切酶對pCAG_Cre載體進行雙酶切，將切下的Cre⑶S序列連接進前述連接有Lcn5啟動子的pUBC載體，構建好的載體命名為Lcn5(1.8)-Cre轉基因載體，該轉基因載體的全長序列如SEQ ID NO:3所示。
[0117]2.體外Cre重組酶表達活性驗證
[0118]為了測試Lcn5 ( L 8)-Cre轉基因載體是否具有轉錄活性Cre重組酶的能力，在HEK293T細胞上進行了過表達實驗。參考羅氏轉染試劑FuGENE?HD TransfectionReagent的操作方法，其中以UBb-DsRechemGFP為Cre重組酶指示載體，RFP位于兩個1xP位點之間，GFP位于第二個1xP之后，當有活性Cre重組酶表達時，紅色熒光減弱或消失，綠色熒光開始表達。分別共轉染UBb-DsRed-emGFP和Lcn5 (1.8)_Cre。72h后通過熒光顯微鏡觀察紅綠熒光的表達。
[0119]圖2顯示了附睪頭部特異基因啟動子驅動Cre重組酶轉基因過表達載體構建和體外活性驗證結果，具體地:Ca)為Lcn5 (1.8) -Cre轉基因載體示意圖，骨架為pUBC轉基因過表達載體，1.8kb啟動子序列來自在附睪頭部中遠端主細胞表達的Lcn5基因；(b)顯示了Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體能在HEK 293T細胞上表達Cre重組酶mRNA，Lcn5基因受雄激素調控，需共轉AR過表達載體并補充雄激素，NTC為非模板對照，AR，雄激素受體表達載體，PCAG-Cre為陽性對照；(c)顯示Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體能驅動活性Cre重組酶表達，UBb-DsRed-emGFP為Cre重組酶活性報告載體，RFP位于兩個1xP位點之間，GFP位于第二個1xP之后，當有活性Cre重組酶表達時，紅色熒光減弱或消失，綠色熒光開始表達。
[0120]實施例2
[0121]轉基因小鼠構建和鑒定
[0122]1.使用SgrD I和Fsp I限制性內切酶對實施例1制備的Lcn5( 1.8)_Cre轉基因載體進行線性化，通過原核顯微方法制備轉基因小鼠，轉基因小鼠背景為C57BL/6 (Palmiter和 Brinster 1985)。
[0123]抽提鼠尾DNA，并通過引物對
[0124]Tg-Cre-S:5’ GCCTGCATTACCGGTCGATGC3’ (SEQ IDNO:8)和[0125]Tg-Cre-A: 5’ CAGGGTGTTATAAGCAATCCC3’ (SEQ ID NO:9)進行 PCR 擴增，檢測陽性
轉基因小鼠并建系。
[0126]圖3顯示轉基因首建鼠鑒定和建系，通過原核顯微注射技術共出生38只首建鼠，通過PCR技術鑒定其中有11只轉基因陽性鼠，WT為野生型小鼠。
[0127]實施例3
[0128]RT-PCR和定量PCR檢測轉基因小鼠Cre重組酶mRNA時空表達特性
[0129]采取Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠不同組織，參考TRIzol試劑(LifeTechnologies, USA)的操作方法抽提總 RNA,利用 ReverTraAce-a (FSK-100, Τ0Υ0Β0)反轉錄試劑盒將 RNA 反轉錄為 cDNA。通過 Tg-Cre-S 和 Tg-Cre-A(序列同上)檢測Cre重組酶mRNA組織特異性表達。
[0130]另外以引物對Lcn5-CDS-S:5’TCAGCGAAGTACAAGGTCACC 3’ (SEQ IDNO:10)和Lcn5-CDS-A:5’CATTGTTGTCCAAGCTCCG (SEQ ID NO:11)檢測內源性 Lcn5 基因表達作為樣品陽性控制。
[0131]設計PCR 引物對 cre-S:5’GACCAGGTTCGTTCACTCATGGA 3’ (SEQ IDNO:12)和cre-A: 5' AACATTCTCCCACCGTCAGTACG 3’ (SEQ ID NO: 13)，通過定量 PCR 的方法檢測 Cre 重組酶mRNA在附睪頭部發育表達特性。
[0132]圖4顯示了 Lcn5(1.8)_Cre轉基因小鼠Cre重組酶mRNA的時空表達譜；(a):Lcn5(1.8)-Cre轉基因小鼠在附 睪頭部特異表達Cre重組酶mRNA; (b)，(c):Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠Cre重組酶mRNA在出生后30天的附睪頭部開始表達，50-60天表達量達到最高，繼而有所下降，NTC為非模板對照，TG為轉基因小鼠，WT為野生型小鼠。
[0133]實施例4
[0134]利用Cre重組酶報告小鼠mT/mG鑒定轉基因小鼠表達Cre重組酶時空特性
[0135]將Lcn5 (1.8) -Cre與mT/mG轉基因小鼠進行交配，篩選雙陽性轉基因子代小鼠。取睪丸和附睪組織進行熒光檢測。另外對附睪組織進行冰凍切片，通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。
[0136]圖5顯示了 Cre重組酶在體內組織特異性和發育時間表達活性；(a) Lcn5(1.8 )-Cre轉基因小鼠與Cre重組酶活性報告基因轉基因小鼠mT/mG交配，檢測子代雙轉基因小鼠GFP表達，GFP僅僅在附睪頭部表達，在其它組織無GFP信號，表明Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠Cre重組酶在該特定區域表達并具有切割活性；(b)檢測不同發育時間點子代雙轉基因小鼠發現GFP在附睪頭部亮度增加，顯示Cre表達隨發育時間增加而升高，活性加強。
[0137]圖6顯示了 Cre重組酶在組織和亞細胞中的定位:Lcn5 (1.8)_Cre轉基因小鼠與Cre重組酶活性報告基因小鼠mT/mG交配，檢測子代雙轉基因小鼠紅色熒光和綠色熒光表達，發現有綠色熒光表達表示有活性Cre重組酶存在；(a)、(b) Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠在附睪頭部中遠端表達活性Cre重組酶；(c)Lcn5 (1.8)-Cre轉基因小鼠在附睪頭部主細胞表達活性Cre重組酶，AQP 9作為主細胞marker。
[0138]實施例5
[0139]利用Aiplfim轉基因小鼠進一步測試轉基因小鼠表達活性Cre重組酶的能力
[0140]將Lcn5 (1.8) -Cre與Aiplfim轉基因小鼠進行交配，篩選雙陽性轉基因子代小鼠。以不同組織和不同發育階段附睪頭部組織基因組DNA為模板。通過引物對AIPl-KO-F:5’GACTGACTGCATCCCAAGGACTAG 3’ (SEQ ID NO: 14)和 AIP1-K0-R:5’TTGCACAGAGGTGAATGACAGAG (SEQ ID NO: 15)檢測Cre切割后的基因組產物。
[0141]圖1顯示了轉基因小鼠表達活性Cre重組酶的時空特性；Aiplfl/fl轉基因小鼠作為測試Lcn5 (1.8) -Cre轉基因小鼠的報告基因小鼠，Lcn5 (1.8) -Cre與Aiplfim轉基因小鼠交配，檢測子代雙轉基因小鼠Lcn5 (1.8)-Cre;AipIfimCre重組酶切割后的目的片段；(a)Aiplfl/fl轉基因小鼠基因組1xP位點示意圖；(b) (c)Cre重組酶在30天開始表達，在附睪頭部區域能切割目標基因；WT表示野生型；Aipl-K0表示在附睪頭部條件性敲除Aipl基因。
[0142]實施例6
[0143]Lcn5 (5.2)-Cre重組酶轉基因小鼠Cre重組酶未表達
[0144]采用與上述構建Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體相同的策略，發明人構建了 Lcn5(5.2)-Cre轉基因過表達載體，見圖8 (a)。
[0145]其中擴增5.2kb Lcn5 啟動子的引物序列為:Lcn5(5.2)_S:5’ ACGACGCGTCAAATGGAGAAACTGAGATAAATA 3’(SEQ ID NO:16)和Lcn5(5.2)_A:5’CGTGGTACCTGGGTTCAGCTCCCCACCAG3’ (SEQ IDNO:17)。
[0146]構建好的載體通過測序驗證正確后，首先在HEK 293T細胞上與Cre重組酶紅綠熒光蛋白報告載體進行共轉染驗證，結果能檢測到該轉基因載體具有Cre重組酶切割活性。
[0147]進一步，發明人通過原核注射方法構建轉基因小鼠，檢測鼠尾基因組DNA，得到數只陽性首建鼠，進而通過RT-PCR鑒定不同line轉基因小鼠多個組織Cre重組酶mRNA表達。
[0148]圖8 (b)顯示了來 自不同line的Lcn5 (5.2)_Cre轉基因小鼠Cre的組織表達特性，結果發現，轉基因小鼠附睪組織未檢測到Cre的mRNA表達。原因可能是轉基因片段在小鼠基因組中進行隨機插入，因此可能會插入到一些抑制區導致轉入的基因不表達；其次是5.2kb的Lcn5啟動子活性不如1.8kb，未能正常驅動外源基因在體內表達。
[0149]實施例7
[0150]Lcn5 (1.8) _CreERT2重組酶轉基因小鼠的建立
[0151]采用與上述構建Lcn5 (1.8)-Cre轉基因載體類似的策略，發明人構建了 Lcn5
(1.8)-CreERT2轉基因過表達載體。模板為市售的pCAG_CreERT2載體分別用EcoRV單酶切，將CreERT2連接進市售的pUBC轉基因載體中，再將1.8kb的Lcn5啟動子連接到目的載體中。
[0152]構建好的Lcn5 (1.8)_CreERT2轉基因載體通過測序驗證正確后，首先在HEK293T細胞上與Cre重組酶紅綠熒光蛋白報告載體進行共轉染驗證，結果能檢測到該轉基因載體具有Cre重組酶切割活性，并其活性能受他莫西芬(tamoxifen)誘導調控。
[0153]進一步通過原核注射方法構建轉基因小鼠，檢測鼠尾基因組DNA，得到數只陽性首建鼠，進而與mT/mG轉基因小鼠(Cre重組酶活性報告轉基因小鼠)交配，檢測后代雙轉基因GFP表達。
[0154]圖9顯示了 Lcn5 (1.8) _CreERT2 ;mT/mG雙轉基因小鼠在附睪頭部中遠端特定區域檢測到GFP信號，顯示Lcn5 (1.8)-CreERT2轉基因小鼠在附睪頭部中遠端特定區域表達有活性的CreERT2。此轉基因小鼠結果再一次證明了 1.8kb片段長度的Lcn5基因啟動能準確驅動外源基因在附睪特定區域表達。
[0155] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種轉基因構建物，其特征在于，所述的構建物包括外源Cre基因以及與外源Cre基因可操作連接的啟動子元件；其中，所述的啟動子元件是脂質運載蛋白5 (Lipocalin5)的啟動子或其活性片段，并且所述啟動子具有驅動外源Cre基因在動物附睪頭部特異表達的功能。
2.如權利要求1所述的轉基因構建物，其特征在于，所述的啟動子元件選自下組: (a)核苷酸序列如SEQID N0.:1所示的多核苷酸； (b)核苷酸序列與SEQID N0.:1所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%)，且具有驅動外源基因在動物附睪頭部中特異表達的功能的多核苷酸； (c)如SEQID N0.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1_60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸，且具有驅動外源基因在動物附睪頭部特異表達功能的多核苷酸。
3.如權利要求1所述的轉基因構建物，其特征在于，所述的外源Cre基因具有如SEQIDN0.: 2所示的核苷酸序列。
4.一種基因表達盒，其特征在于，所述基因表達盒從5’至3’依次具有下述元件:啟動子元件、Cre基因的ORF序列、和終止子序列，并且所述的啟動子元件是脂質運載蛋白5(Lipocalin5)的啟動子或其活性片段，所述啟動子具有驅動Cre基因在動物附睪頭部特異表達的功能。
5.一種載體，其特征在于，所述載體含有或權利要求1所述的轉基因構建物，或權利要求4所述的基因表達盒。
6.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求5所述的載體、或其染色體整合有權利要求1所述的轉基因構建物、或其染色體整合有權利要求4所述的基因表達盒。
7.權利要求1所述的轉基因構建物、或權利要求4所述的基因表達盒的用途，其特征在于，用于特異性調控外源Cre基因在動物附睪頭部特異表達。
8.一種制備轉基因動物的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供轉基因的動物細胞，所述動物細胞含有權利要求5所述的載體、或其染色體整合有權利要求1所述的轉基因構建物、或其染色體整合有權利要求4所述的基因表達盒； (b)將步驟(a)所述的轉基因的細胞再生為動物，從而獲得轉基因動物。
9.一種轉基因動物的用途，所述的轉基因動物是用權利要求8所述的方法制備的，其特征在于，所述的轉基因動物用于小鼠附睪頭部區域特異敲除或過表達目標靶基因。
10.一種在動物附睪頭部特異性表達外源Cre基因的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供權利要求1所述的轉基因構建物； (b)將步驟(a)中的轉基因構建物導入動物細胞，獲得轉化的動物細胞； (c)將步驟(b)中轉化的動物細胞再生成動物，從而使外源Cre基因在動物附睪頭部特異性表達。
11.一種在動物附睪頭部區域特異敲除目標靶基因的方法，其特征在于，包括步驟: (1)提供權利要求1所述的轉基因構建物； (2)用步驟(1)的轉基因構建物轉化動物細胞，獲得轉化的動物細胞； (3)將步驟(2)中轉化的動物細胞再生成動物，從而使外源Cre基因在動物附睪頭部特異性表達；(4)將步驟(3)中獲得的轉基因動物與f 1xed化的轉基因動物交配，從而可獲得特異敲除目標基因的子代動 物。
【文檔編號】C12N5/10GK103849634SQ201210507321
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月30日 優先權日:2012年11月30日
【發明者】張永蓮, 謝勝松, 黃行許, 徐娟 申請人:中國科學院上海生命科學研究院