人羊膜間充質干細胞的分離方法
【專利摘要】本發明提供一種酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)培養人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)的過程中的hAMSCs的分離方法，所述培養過程包括如下步驟：hAMSCs的分離，hAMSCs的原代培養，hAMSCs的傳代培養與擴增，hAMSCs的凍存和復蘇，以及hAMSCs細胞免疫表型的檢測。本發明采用胰蛋白酶和膠原酶分步多次消化來收集羊膜細胞，通過加入4ng/mlEGF，將貼壁培養和消化時間控制相結合，獲得純度和活性較高人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)。本發明的酶消化法聯合聯合EGF具有操作簡單，快速實用等優點，是一種較為有效的分離純化hAMSCs的方法。
【專利說明】人羊膜間充質干細胞的分離方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】的一種培養人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)的方法，特別涉及一種采用酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)來培養人羊膜間充質干細胞的過程中的人羊膜間充質干細胞的分離方法。
【背景技術】
[0002]正常人羊膜組織結構分為上皮細胞層、基底膜、致密層、纖維細胞層及海綿層，其中人羊膜間充質干細胞(human amnion membranemesenchymal stem cells, hAMSCs)位于羊膜的最內層，是在受精后第8天從外胚葉發育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性，擁有更大的多向分化潛能，hAMSCs理論上可以分化成各種組織細胞，同時因羊膜獲得方便且回避了倫理學爭議，有潛力成為未來臨床應用的干細胞來源之一。hAMSCs原代培養分為組織塊培養和酶消化法培養，組織塊培養由于不是每個組織塊都能培養成功，且容易混雜有成纖維細胞污染，培養形成單層的時間較長，不利于快速大量獲取細胞，難以滿足干細胞研究的需要；酶消化法鑒于羊膜組織結構致密，結構致密，用酶一次消化時間過長對細胞損傷較大，時間太短得到的細胞數量太少。因此有必要建立一種在體外分離、純化并大量擴增和誘導分化hAMSCs的方法。

【發明內容】

[0003]為建立一種在體外分離、純化并大量擴增和誘導分化hAMSCs的方法，本發明提供一種采用酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)培養人羊膜間充質干細胞的方法，通過采用胰蛋白酶和膠原酶分步多次消化來收集羊膜細胞，此時的羊膜細胞是上皮細胞、間質干細胞、成纖維細胞等多種細胞的混合物，加入表皮生長因子(EGF)，將貼壁培養和消化時間控制相結合，可獲得純度和活性較高人羊膜間充質干細胞。
[0004]具體的，本發明的酶消化法聯合EGF培養人羊膜間充質干細胞的方法包括如下步驟:hAMSCs的分離，hAMSCs的原代培養，hAMSCs的傳代培養與擴增，hAMSCs的凍存和復蘇，以及hAMSCs細胞免疫表型的檢測。
[0005]其中，所述hAMSCs的分離步驟包括:無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗數次以清除殘留血跡，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1mm3碎塊，加入胰蛋白酶37°C消化10分鐘；加入含小牛血清的DMEM終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入II型膠原酶消化液， 37°C消化30分鐘；加入含小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；1000轉/分鐘離心5分鐘；臺盼蘭染色計數活細胞，調整細胞密度為IX 106/ml，接種至培養瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培養基；置37°C、飽和濕度、體積分數5%的CO2培養箱內培養，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液1次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80%后，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液于 37°C消化2-3分鐘，加入培養基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮后，以IXlOVml的細胞密度傳代；傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟。
[0006]所述hAMSCs的原代培養步驟包括:將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000rpm離心15分鐘，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘進行15分鐘洗滌，收集細胞；接種細胞前吸取FBS加入細胞培養瓶，置37°C，5% CO2，飽和濕度培養箱孵育30分鐘，對培養瓶進行包被；棄包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數細胞；調整細胞濃度為1.0XlO6細胞/ml，接種于包被后的細胞培養瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中培養，相差顯微鏡動態觀察；培養4-5天后全量換液,棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次。觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，所得細胞為原代細胞。
[0007]所述hAMSCs的傳代培養與擴增步驟包括:觀察原代hAMSCs細胞貼壁生長至80-90%匯合時，吸棄培養瓶內原有培養液，吸取PBS緩沖液輕輕加入培養瓶內洗滌，棄去洗液；加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化液浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察，見細胞間隙增大，胞質回縮，搖動吹打后見細胞呈圓形漂起時加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，按1: 2-1: 3比例傳代培養；培養體系為20% FBS,4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培養液15ml/瓶；置37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中培養，計為第I代hAMSCs，待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行多代細胞培養擴增。
[0008]所述hAMSCs細胞免疫表型的檢測步驟包括:取培養第2或第3代細胞，首先用胰蛋白酶消化后，然后用含小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至IXlOVml ;分別加入鼠抗人單克隆抗體，置4°C孵育半小時，PBS洗I次，進行流式細胞儀檢測分析。
[0009]優選的，所述的hAMSCs的凍存和復`蘇步驟中，所述的hAMSCs的凍存操作如下:取出所需試劑，配制凍存液，每個凍存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上預冷；取出需要凍存的細胞，吸棄培養瓶中原有的培養基，用PBS緩沖液輕輕清洗后，吸棄洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆蓋瓶底，放入37°C孵箱中2-3分鐘；在倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形飄起時，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培養液，反復吹打，用微量加樣槍吸出少許用做細胞計數；將細胞懸液移入離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，離心結束，吸棄上清；向離心管中加入人AB血清，充分混勻，待用；將上述臍帶源間充質干細胞懸液加入到凍存管中，封蓋，震蕩，充分混勻，放置在4°C冰箱30分鐘后迅速移入到-80°C，24小時后，移入液氮中，進行長期保存。
[0010]再優選的，所述的hAMSCs的凍存和復蘇步驟中，所述hAMSCs的復蘇的操作包括:取出所需試劑，平衡至室溫，準備370C水浴備用；從液氮中迅速取出需要復蘇的凍存管，立即于37°C水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭凍存管蓋周圍，旋開管蓋；在超凈臺內將凍存管內的細胞移入到無菌離心管內，緩慢逐滴加入DMEM/F12培養液，輕輕混勻；1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；加入DMEM/F12完全培養液重懸細胞后接種，每個培養瓶中補加新的完全培養液；置5% C02，飽和濕度，37°C培養箱重新培養。
[0011]本發明的酶消化法聯合聯合EGF，將貼壁培養和消化時間控制相結合，具有操作簡單快速，實用穩定等優點，不失為一種較為有效的分離純化方法。【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中:
[0013]圖1所示為本發明的酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)培養人羊膜間充質干細胞的過程的步驟流程圖；
[0014]圖2所示為酶消化法聯合EGF培養人羊膜間充質干細胞的過程中人羊膜間充質干細胞的分離方法步驟流程圖。
【具體實施方式】
[0015]如圖1所示，本發明的一實施例的酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)培養人羊膜間充質干細胞的方法包括如下步驟:
[0016]S1、人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)的分離:
[0017]參見圖2所示，本步驟具體為:無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤(經家屬同意)，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’s液沖洗數次以清除殘留血跡，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約lmm3碎塊，加入2.5g/L胰蛋白酶370C消化IOmin ;加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，370C消化0.5h ;加入含5%小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；1000r/min，離心5min ;臺盼蘭染色計數活細胞，調整細胞密度為1父106/1111，接種至250112培養瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培養基；置370C、飽和濕度、體積分數5%的C02培養箱內培養，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液I次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80 %后，用0.25 %胰蛋白`酶-0.02 % EDTA溶液于37°C消化2_3min，加入培養基終止胰蛋白酶作用，1000r/min,離心5min,棄上清,細胞沉淀用培養基重新懸浮后，以IX 107/ml的細胞密度傳代。傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟。
[0018]S2、hAMSCs 的原代培養:
[0019]將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000rpmX15分鐘離心，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用0.01M PBS30mL吹打成均勻懸液，1500rpmX15分鐘洗滌2次，收集細胞；接種細胞前吸取FBS3mL加入T75cm2型細胞培養瓶，置37°C ,5% CO2，飽和濕度培養箱孵育30分鐘，對培養瓶進行包被；棄包被液，用含20%FBS,4ng/ml表皮生長因子(epidermal growthfactor, EGF)的DMEM/F12完全培養液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數細胞；調整細胞濃度為1.0X IO6細胞/ml，接種于包被后的T75cm2型細胞培養瓶中，置于37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中培養，相差顯微鏡動態觀察；培養4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次。觀察細胞貼壁生長至80-90%匯合時，以0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，所得細胞為原代細胞。
[0020]首先應用高密度貼壁細胞培養I XlOVml，原代細胞聚集成團塊狀，團塊中可形成少量克隆球，但克隆球生長緩慢。原代培養24-48小時后，可見細胞從組織塊中爬出，圍繞在組織塊周圍，呈放射狀向外生長。UC-MSC呈貼壁生長，懸浮細胞可經過多次換液去除，細胞逐漸得以純化。培養5d后后吸出部分細胞改為I X 106/ml培養，克隆球形成和生長明顯增快。首次換液發現，每高倍鏡視野(倒置顯微鏡X 100倍)下大約有200個細胞貼壁，其中處于有絲分裂期的極強折光性大細胞平均大約有5個，少數散在的貼壁細胞出現分化現象；培養I周時倒置顯微鏡可見貼壁細胞呈梭形、多角形，增長速度較快。2周時極強折光性大細胞數量增多，至每高倍視野下大約有20個，成為形態相對均一的梭形細胞，呈放射狀排列生長或旋渦狀生長，多數貼壁未分裂的原代細胞和分化細胞開始脫落死亡，此時經多次換液去除懸浮細胞，細胞密度由IXlOVml降至IXioVml左右，無細胞聚集現象；第2_3周可形成80%融合的的單層貼壁細胞層，3周時已經有極強折光性大細胞開始形成緊密小克隆球(大約5~20個細胞組成，直徑約40~60 μ m) ;4周時已有大量大小不等的克隆球形成，許多大克隆球(直徑大于200 μ m)已脫壁懸浮生長。
[0021 ] S3、hAMSCs的傳代培養與擴增:
[0022]觀察原代hAMSCs細胞貼壁生長至80-90 %匯合時，吸棄培養瓶內原有培養液，吸取IOml 0.01M PBS緩沖液輕輕加入培養瓶內洗滌，棄去洗液；加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化液1.0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察，見細胞間隙增大，胞質回縮，搖動吹打后見細胞呈圓形漂起；加入1.0ml FBS中止胰酶消化；加入IOml0.01MPBS反復吹打沖洗，在室溫下900rpmX 10分鐘離心；棄去上清液，加入IOml DMEM/F12重懸細胞，按1: 2-1: 3比例傳代培養；培養體系為20% FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培養液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，飽和濕度的細胞培養箱中培養，計為第I代(passagel，Pl)hAMSCs，待細胞生長至80-90%匯合時，重復上述操作進行P2、P3、P4…代細胞培養擴增。
[0023]當細胞貼壁生長至80-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，按1:2-1: 3的比例傳代。傳代細胞于接種后3-6小時迅速貼壁，最初為短粗的梭形或卵圓形。在接種的第2天，細胞伸展為長梭形或多角狀，體積較大，細胞均勻分布。傳代后細胞增殖速度明顯加快，在接種后第2-3天增長趨勢最為顯著，數量明顯增多，生長較均勻一致。傳代后3-4天時，細胞 長滿培養瓶底，融合成片狀，低倍鏡下細胞排列緊密，整齊有序，出現漩渦樣結構，雜質細胞已明顯少見。
[0024]S4、hAMSCs的凍存和復蘇:
[0025]其中，所述的hAMSCs的凍存操作如下:
[0026]I)取出所需試劑，配制凍存液。每個凍存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上預冷。在凍存管上詳細標記細胞情況，如種類、代數以及凍存時間等；
[0027]2)取出需要凍存的細胞，吸棄培養瓶中原有的培養基。用20ml PBS緩沖液輕輕清洗兩次后，吸棄洗液:
[0028]3)每瓶中加入0.25%胰酶-0.04% EDTA工作液1ml，浸漫覆蓋瓶底，放入37°C孵箱中2-3分鐘；
[0029]4)在倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形飄起時，加入1.0ml胎牛血清中止胰蛋白酶消化。如果細胞不易飄起，可用手掌輕輕拍打培養瓶確保細胞完全消化下來；
[0030]5)每瓶中加入完全培養液20ml，反復吹打。用微量加樣槍吸出少許用做細胞計數。
[0031]6)將細胞懸液移入50ml離心管中，離心1000rpmX5分鐘，離心結束，吸棄上清。
[0032]7)向離心管中加入1.0ml人AB血清，充分混勻，待用。
[0033]8)將上述臍帶源間充質干細胞懸液加入到凍存管中，封蓋，震蕩，充分混勻，放置在4°C冰箱30分鐘后迅速移入到_80°C。
[0034]9)24小時后，移入液氮中，進行長期保存。
[0035]所述hAMSCs的復蘇的操作包括:
[0036]I)取出所需試劑，平衡至室溫。準備370C水浴備用；
[0037]2)從液氮中迅速取出需要復蘇的凍存管，確認后立即于37°C水浴中迅速融化；
[0038]3)用酒精棉球擦拭凍存管蓋周圍，旋開管蓋； [0039]4)在超凈臺內將凍存管內的細胞移入到50ml無菌離心管內。緩慢逐滴加入20mlDMEM/F12培養液，輕輕混勻，盡量不要產生氣泡；
[0040]5)離心，1000rpmX 5分鐘，棄上清；
[0041]6)加入IOml DMEM/F12完全培養液重懸細胞后接種，每個培養瓶中補加新的完全培養液至15ml。置5% C02，飽和濕度，37°C培養箱重新培養；
[0042]7)在培養瓶上標記細胞相關信息，如種類、代數以及復蘇時間等。
[0043]S5、hAMSCs細胞免疫表型的檢測:
[0044]取培養第2或第3代細胞，首先用0.25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至I X 107/ml。分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:⑶34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小時，PBS洗I次，進行流式細胞儀檢測分析。流式細胞儀檢測顯示，hAMSCs表達CD29、CD44 和 CD105,不表達 CD34、CD45、CD19、HLA-DR 和 CD106。。
[0045]本實施例采用采用胰蛋白酶和膠原酶分步多次消化來收集羊膜細胞，此時的羊膜細胞是上皮細胞、間質干細胞、成纖維細胞等多種細胞的混合物，但在加入4ng/ml表皮生長因子(EGF)，將貼壁培養和消化時間控制相結合，獲得純度和活性較高人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)。根據hAMSCs貼壁生長的特點，培養2_3天后可見hAMSCs基本貼壁，因此在原代培養末期即可以獲得均一性較好的hAMSCs。同時發現，盡管使用了貼壁密度梯度法，在原代培養體系中仍然存在一些造血系細胞，這些細胞在加入4ng/ml EGF后大部分不能貼壁，隨換液而被去除，hAMSCs具有成纖維細胞生長的特點，體積小，呈梭形，核漿比大，體外增殖迅速，生長狀態穩定，而且隨著換液次數和傳代次數的不斷增加，細胞純度不斷增加，均質性不斷提高，細胞呈均勻有序的成纖維細胞樣，隨著傳代次數的增加，細胞的增殖速度未見明顯下降，細胞的均一性經過傳代培養明顯提高。酶消化法聯合聯合EGF，將貼壁培養和消化時間控制相結合，具有操作簡單快速，實用穩定等優點，不失為一種較為有效的分離純化方法。
[0046]本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
【權利要求】
1.一種人羊膜間充質干細胞的分離方法，其應用于酶消化法聯合EGF培養人羊膜間充質干細胞的過程，所述培養過程包括如下步驟:hAMSCs的分離，hAMSCs的原代培養，hAMSCs的傳代培養與擴增，hAMSCs的凍存和復蘇，以及hAMSCs細胞免疫表型的檢測；其特征在于，所述hAMSCs的分離步驟包括: 無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗數次以清除殘留血跡，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約Imm3碎塊，加入胰蛋白酶37°C消化10分鐘； 加入含小牛血清的DMEM終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾； 過濾后的羊膜組織中加入II型膠原酶消化液，37°C消化30分鐘；加入含小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；1000轉/分鐘離心5分鐘；臺盼蘭染色計數活細胞，調整細胞密度為I X 106/ml，接種至培養瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培養基；置37°C、飽和濕度、體積分數5%的CO2培養箱內培養； 倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液I次，并攝片記錄； 待細胞匯合度達80 %后，用0.25 %胰蛋白酶-0.02 % EDTA溶液于37 °C消化2_3分鐘，加入培養基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮后，以I X IOVml的細胞密度傳代；以及 傳代過程中，隔日換液I次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟。
【文檔編號】C12N5/0775GK103789258SQ201210506430
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月30日 優先權日:2012年11月30日
【發明者】陸華 申請人:陸華