本發明涉及一種基于干細胞源外泌體的組合物及其在制備治療心肌梗死的藥物中的應用，屬于生物醫藥
技術領域：
。
背景技術：
：冠狀動脈疾病是最常見的心血管疾病，心肌梗死則是其中發病率和死亡率位居首位的。目前，利用干細胞移植方法治療心肌梗死被認為是修復受損心肌和促進心肌細胞再生最具潛力的治療方法，但移植的干細胞在缺血缺氧環境中的存活率、有效性及相關作用機制等仍存在較大爭議。干細胞旁分泌效應對心肌細胞的保護作用在近些年來逐漸受到重視。外泌體是干細胞旁分泌效應的典型代表，近年來對于其參與心血管疾病生理及病理過程的機制探索以及將基于外泌體的研究轉化于臨床心臟疾病的診治已成為研究前沿中的熱點。外泌體是在不同應激反應中所產生的直徑在30～100nm之間的具有雙層膜結構的囊性小泡，其富含大量與其母體干細胞相關的mirna、mrna及蛋白質。外泌體經細胞釋放后入血，傳遞物質和信號至靶細胞，這種細胞間的通訊方式在許多疾病的發生發展以及損傷修復中發揮重要作用。干細胞來源的外泌體，可以利用攜帶的干細胞特異的mirna和蛋白分子等，刺激靶細胞向心臟保護和再生方向發生轉化。目前研究發現，利用不同干細胞來源的外泌體治療心肌梗死(myocardialinfarction，mi)后均具備能夠改善心臟功能、減少梗死面積、增加新生血管數量等作用效果。外泌體對mi的治療效果已得到廣泛證實，其解決了干細胞在治療缺血性心臟病中面臨的細胞存活率低的重要問題。間充質干細胞(mesenchymalstemcells，msc)是具有自我更新和多向分化能力的細胞，能夠通過旁分泌途徑促進細胞修復及血管生成，在再生醫學領域中扮演重要角色。許多研究表明，msc外泌體在治療組織損傷性疾病中發揮重要作用，特別是在心肌梗死治療中表現突出。lai等人(laietal，stemcellresearch，2010)和arslan等人(arslanetal，stemcellresearch，2013)的研究發現，在小鼠心肌梗死模型中，msc外泌體可以將心肌梗死面積降低約40-50％。然而，如何進一步提高其治療效果仍有待進一步研究。技術實現要素：為解決上述技術問題，提高msc外泌體在治療心肌梗死中的作用，本發明的目的在于提供三葉因子3(trefoilfactor3，tff3)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)聯合msc外泌體組成的組合物及其在制備治療心肌梗死的藥物中的應用。為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于干細胞源外泌體的組合物，包括間充質干細胞外泌體、三葉因子3和超氧化物歧化酶，三者的質量比為20∶10-100∶2000-10000。優選地，三者的質量比為20∶10或30或100∶2000或10000。在上述組合物中，優選地，所述三葉因子3為人重組三葉因子3。在上述組合物中，優選地，所述超氧化物歧化酶為人重組超氧化物歧化酶。在上述組合物中，優選地，所述間充質干細胞外泌體、三葉因子3和超氧化物歧化酶的質量比為20∶10∶10000。在上述組合物中，優選地，該組合物還包括溶劑。在上述組合物中，優選地，所述溶劑為pbs緩沖液和/或0.9％的生理鹽水。在上述組合物中，優選地，所述間充質干細胞外泌體和超氧化物歧化酶溶于pbs緩沖液中，其中，間充質干細胞外泌體的濃度優選為10μg/ml，超氧化物歧化酶濃度為1-5mg/ml；所述三葉因子3溶于濃度為0.9％的生理鹽水中，其中，三葉因子3的濃度為0.5-5μg/ml。本發明還提供了一種制備上述組合物的方法，其可以通過將各種組分溶解于相應的溶劑中，然后再將其混合制備得到，其中，間充質干細胞外泌體和超氧化物歧化酶混合溶解于溶劑中形成混合制劑，三葉因子3則溶解于另一溶劑中，兩部分成分單獨存放。在使用時，tff3溶液的給藥方式為腹腔注射，含有間充質干細胞外泌體和超氧化物歧化酶的混合制劑的給藥方式為病灶局部注射給藥。本發明所提供的組合物的制備方法可以包括如下具體步驟：(1)將三葉因子3溶解于濃度為0.9％的生理鹽水中，濃度為0.5-5μg/ml，得到tff3溶液；(2)將間充質干細胞外泌體重懸于pbs緩沖液中，濃度為20μg/ml，得到混懸液；(3)將超氧化物歧化酶溶解于pbs緩沖液中，濃度為2-10mg/ml，得到sod溶液；(4)將等體積的混懸液與sod溶液混勻，并將混合物體積定量為混懸液的體積或sod溶液的體積的兩倍，即得到所述組合物。本發明還提供了上述組合物在制備治療心肌梗死的藥物中的應用。在上述應用中，優選地，所述心肌梗死包括急性心肌梗死、無痛性心肌梗死、非st段抬高心肌梗死、右室心肌梗死和心房心肌梗死中的至少一種。在上述應用中，優選地，間充質干細胞外泌體的給藥量為20μg/kg·d，三葉因子3的給藥量為10μg/kg·d，超氧化物歧化酶的給藥量為10mg/kg·d。在三葉因子3的給藥量為10μg/kg·d時，三葉因子3本身并不具有緩解心肌梗死的作用，也沒有表現出對于間充質干細胞外泌體緩解心肌梗死效果的促進作用，而且，超氧化物歧化酶并沒有表現出對于間充質干細胞外泌體緩解心肌梗死效果的促進作用，但是，當三葉因子3、超氧化物歧化酶與間充質干細胞外泌體組合在一起，且將三葉因子3的給藥量控制為10μg/kg·d、將超氧化物歧化酶的給藥量為10mg/kg·d時，能夠大大促進間充質干細胞外泌體緩解心肌梗死的效果。在上述應用中，優選地，超氧化物歧化酶的給藥方式為腹腔注射，間充質干細胞外泌體和超氧化物歧化酶的給藥方式為病灶局部注射給藥；更優選地，上述藥物可以為注射劑。本發明的有益效果在于：本發明提供的三葉因子3、超氧化物歧化酶聯合msc外泌體的組合物可以有效增強msc來源的外泌體在治療心肌梗死中的作用，進一步降低心肌梗死造成的損傷。附圖說明圖1為外泌體電鏡觀察圖。圖2為外泌體的特異性標志物cd81、cd63免疫印跡圖。圖3為tff3給藥、tff3聯合msc外泌體給藥、sod聯合外泌體給藥對心肌梗死的影響柱狀圖。圖4為tff3、sod聯合外泌體給藥對心機梗死的影響柱狀圖。圖5為tff3、sod聯合外泌體給藥對cd68陽性細胞數量的影響柱狀圖。具體實施方式為了對本發明的技術特征、目的和有益效果有更清楚的理解，對本發明的技術方案進行以下詳細說明，但不能理解為對本發明的可實施范圍的限定。實施例1人臍帶來源的msc外泌體的分離鑒定(1)人臍帶來源的間充質干細胞原代分離培養：獲取10cm剖腹產新生兒臍帶組織，采用磷酸緩沖鹽溶液(pbs緩沖液)充分去除血污，其中pbs緩沖液含有5wt％青霉素-鏈霉素(青霉素終濃度為100u/ml，鏈霉素終濃度為0.01g/100ml)；將臍帶洗凈后，均勻剪成長度為3-4cm的小段，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠剪碎為1-3mm3的小塊，加入15ml膠原酶a溶液(濃度為1mg/ml)和中性蛋白酶的混合液(濃度為1mg/ml)，其中二者體積比為1∶2，置于37℃、5％co2的培養箱中消化處理2小時；離心收集細胞和殘余組織，采用含1wt％的青霉素-鏈霉素且無ca2+、mg2+的pbs緩沖液(青霉素終濃度100u/ml，鏈霉素終濃度0.01g/100ml)(購自東方華輝生物醫藥科技有限公司)洗去殘留膠原酶a，于2000rpm離心5分鐘，棄上清；加入15ml含0.02％edta的0.25wt％的胰酶溶液，于37℃、5％co2的培養箱中消化10分鐘；消化處理之后，采用含1wt％青霉素-鏈霉素且無ca2+、mg2+的pbs緩沖液洗去殘留酶，于2000rpm離心5分鐘，棄上清；采用0.1wt％的明膠對培養皿進行包被，于4℃過夜；用無ca2+、mg2+的pbs緩沖液進行洗滌，去除殘留明膠；用bps-sfm無血清培養基(購自東方華輝生物醫藥科技有限公司)重懸組織和細胞，接種于明膠鋪被的培養皿中，置于37℃、5％co2的培養箱培養，待大部分組織團塊周圍細胞生長融合至85％時進行消化傳代。(2)msc外泌體的分離和純化：選擇增殖能力強、狀態好的第3-5代人臍帶間充質干細胞，無血清培養48h后，收集培養上清液30ml；于2,000×g離心30min，取上清液，棄去細胞碎片等沉淀；經0.45μm無菌濾膜過濾到20ml離心管中，于4℃、1,000×g離心60min，得到含外泌體的濃縮液；將濃縮液移至加有200μl質量濃度為300g/l蔗糖的超速離心管中，于4℃、100,000×g離心60min，收集底部沉淀；將所得沉淀采用pbs重懸，再次100,000×g離心60min，收集底部沉淀，即為msc外泌體；將所得外泌體用pbs重懸，采用0.22μm濾膜過濾除菌，并于-80℃儲存。(3)msc外泌體的鑒定：①外泌體的形態學觀察：將實施例1中所得到的外泌體溶液充分混勻，經脫水、干燥、粘樣、導電處理，在掃描電鏡下觀察微粒形態，并拍攝電鏡照片。結果如圖1所示，所獲得的msc外泌體直徑約為50-100nm，符合外泌體特征。②外泌體標志物檢查：采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體的特異表達蛋白cd81、cd63。采用ripa裂解液(購自碧云天生物技術有限公司)對msc和msc外泌體進行蛋白裂解30min，采用勻漿器(型號ikat10)進行蛋白勻漿(15s×3次)；靜置30min后，將上述勻漿液于4℃、12,000g離心15分鐘；采用bca試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司)進行蛋白定量，將總蛋白濃度調至同一水平；加入5×上樣緩沖液(16％甘油、20％-巰基乙醇、2％十二烷基磺酸鈉、0.05％溴酚藍)，煮沸5min。將上述溶液上樣，于濃80v電壓經縮膠電泳約30min，于120v電壓經分離膠電泳約60min；經電轉移(250ma，2h)將蛋白質轉移到pvdf膜(購自millipore)，采用封閉液(含5％bsa的tbst溶液)于室溫封閉1h；將上述pvdf膜分別與兔抗人cd81抗體、cd63抗體(購自abcam)于4℃孵育過夜后，采用tbst洗膜3次，每次10分鐘；之后與辣根過氧化物酶(hrp)標記的山羊抗兔igg二抗于室溫孵育1h后，采用tbst洗膜3次，每次10分鐘；加入ecl化學發光底物(購自abcam)，采用化學發光凝膠成像系統(bio-rad)進行檢測并拍照。實驗結果如圖2所示。msc外泌體組cd81和cd63顯著高于msc組(p＜0.01)，說明msc外泌體高表達外泌體特異性蛋白cd81和cd63。實施例2三葉因子3、超氧化物歧化酶、外泌體的組合物本實施例提供了一種基于外泌體的組合物，其包括三葉因子3、超氧化物歧化酶、外泌體，其中：三葉因子3為人重組三葉因子3(rhtff3)，購自prospec-tany公司；超氧化物歧化酶為人重組超氧化物歧化酶(rhsod)，購自prospec-tany公司；間充質干細胞外泌體(msc-exo)如實施例1所制備。其中，rhtff3的溶劑為0.9％生理鹽水；給藥方式為腹腔注射，給藥一次；給藥劑量分別為10μg/kg，30μg/kg，100μg/kg，對應的濃度分別為0.5μg/ml，1.5μg/ml，5μg/ml。其中，rhsod的溶劑為pbs緩沖液；給藥方式為心肌梗死模型結扎位點附近的兩個位點注射；給藥劑量分別為2mg/kg，10mg/kg，對應的濃度分別為1mg/ml，5mg/ml。其中，msc-exo的溶劑為pbs緩沖液；給藥方式為心肌梗死模型結扎位點附近的兩個位點注射，給藥劑量為20μg/kg，濃度為10μg/ml。其中，當rhsod與msc-exo同時給藥時，其作為組合使用，具體為：將rhsod溶于pbs緩沖液中，并使其濃度為終濃度的兩倍；將msc-exo重懸于pbs緩沖液中，并使其濃度為終濃度的兩倍；之后將上述rhsod的pbs溶液與msc-exo的pbs重懸液混勻，并將終體積定量為單一溶液體積的兩倍，使rhsod的終濃度為1mg/ml或5mg/ml，msc-exo的終濃度為10μg/ml。實施例3三葉因子3、超氧化物歧化酶聯合msc外泌體在制備治療心肌梗死的藥物中的應用(1)小鼠心肌梗死模型建立：動物為c57bl/6小鼠，8-12周齡。異氟烷進行誘導麻醉后，將小鼠固定在加熱毯上，縱行切開頸部皮膚、肌肉，暴露氣管，進行氣管插管，調整呼吸機頻率為100次/分，潮氣量為20ml。于小鼠第四肋間橫行切開皮膚、肌肉，暴露肋骨，剪開肋間肌，撐開器暴露心臟。撕開心包膜，使用手術線于左心耳下放2-3mm結扎冠狀動脈，見心臟顏色變白，表明小鼠心肌梗死模型建立成功。按照上述方法結扎后，msc-exo或sod與msc-exo組合物的給藥方式為在結扎位點附近的左下、右下兩個位點注射；之后關胸，消毒切口。(2)tff3對小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手術后，關胸，消毒切口，將小鼠隨機分為a1、a2、a3、a4共4組，每組6只；立即腹腔注射rhtff3溶液。具體分組及給藥劑量請見表1。表1tff3對小鼠心肌梗死模型的作用分組tff3劑量缺血面積標準差a1049％5％a210μg/kg47％5％a330μg/kg37％7％a4100μg/kg36％8％采用四唑氮藍(ttc)染色方法，觀察治療效果。于手術后第7天無痛處死小鼠，取左心室組織橫向切成約1mm切片，于37℃將切片在1％ttc-pbs中孵育30min，采用4％的甲醛-pbs固定15min，并拍照分析心肌梗死面積。實驗結果如表1和圖3(tff3)所示。a2組與a1組沒有顯著差異，表明10μg/kg劑量tff3給藥不足以緩解心肌梗死程度；a3、a4組與a1組相比，心肌缺血面積顯著降低，表明30μg/kg、100μg/kg劑量tff3均能在一定程度上緩解心肌梗死程度。表明tff3有緩解心肌梗死的作用，但是在10μg/kg的劑量下并沒有該作用。(3)tff3聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手術結扎后，將小鼠隨機分為b1、b2、b3、b4、b5共5組，每組6只；每組動物在結扎位點附近的左下、右下兩個位點注射20μg/kg體重的msc-exo，之后關胸，消毒切口；立即腹腔注射rhtff3溶液。具體分組及給藥劑量請見表2。表2tff3聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用分組tff3劑量msc-exo劑量缺血面積標準差b10051％6％b2020μg/kg30％7％b310μg/kg20μg/kg27％8％b430μg/kg20μg/kg25％7％b5100μg/kg20μg/kg26％9％采用四唑氮藍(ttc)染色方法，觀察治療效果，方法與上述相同。實驗結果如表2和圖3(tff3+exo)所示。與b1組相比，b2組動物的心肌缺血面積顯著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg劑量的外泌體可以有效緩解心肌梗死程度；與b1組相比，b3(p＜0.05)、b4(p＜0.01)、b5(p＜0.05)組動物心肌缺血面積顯著降低，表明10μg/kg、30μg/kg、100μg/kg劑量的tff3與20μg/kg劑量的外泌體聯合使用，均可以有效緩解心肌梗死程度，其中30μg/kg劑量tff3與20μg/kg劑量的外泌體聯合使用效果有一定的提升；然而，b3、b4、b5組動物與b2組沒有顯著差異，表明10μg/kg、30μg/kg、100μg/kg劑量的tff3與20μg/kg劑量的外泌體聯合使用，與20μg/kg劑量的外泌體單獨使用的效果無差異，未產生顯著的促進作用。表明tff3聯合msc-exo對心機梗死的緩解作用效果與msc-exo單獨使用效果相似，tff3對msc-exo的相關作用效果并沒有表現出顯著的促進作用。(4)sod聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手術結扎后，將小鼠隨機分為c1、c2、c3、c4共4組，每組6只；每組動物在結扎位點附近的左下、右下兩個位點注射sod與msc-exo的組合物，之后關胸，消毒切口。具體分組及給藥劑量請見表3。表3sod聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用分組sod劑量msc-exo劑量缺血面積標準差c10050％6％c2020μg/kg31％7％c32mg/kg20μg/kg28％7％c410mg/kg20μg/kg29％9％采用四唑氮藍(ttc)染色方法，觀察治療效果，方法與上述相同。實驗結果如表3和圖3(sod+exo)所示。與c1組相比，c2組動物的心肌缺血面積顯著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg劑量的外泌體可以有效緩解心肌梗死程度；與c1組相比，c3、c4組動物心肌缺血面積顯著降低(p＜0.05)，表明2mg/kg、10mg/kg劑量的sod與20μg/kg劑量的外泌體聯合使用，均可以有效緩解心肌梗死程度；然而，c3、c4組動物與c2組沒有顯著差異，表明2mg/kg、10mg/kg劑量的sod與20μg/kg劑量的外泌體聯合使用，與20μg/kg劑量的外泌體單獨使用的效果無差異，未產生顯著的促進作用。表明sod聯合msc-exo對心機梗死的緩解作用效果與msc-exo單獨使用效果相似，sod對msc-exo的相關作用效果并沒有表現出顯著的促進作用。(5)tff3、sod聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手術結扎后，將小鼠隨機分為d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8共8組，每組6只；每組動物在結扎位點附近的左下、右下兩個位點注射sod與msc-exo的組合物，之后關胸，消毒切口；立即腹腔注射rhtff3溶液。具體分組及給藥劑量請見表4。表4tff3、sod聯合msc-exo對小鼠心肌梗死模型的作用采用四唑氮藍(ttc)染色方法，觀察治療效果，方法與上述相同。實驗結果如表4和圖4所示。與d1組相比，d2組動物的心肌缺血面積顯著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg劑量的外泌體可以有效緩解心肌梗死程度；與d1組相比，d3、d4(p＜0.001)、d5(p＜0.01)、d6、d7、d8組動物心肌缺血面積顯著降低(d3、d6-8組p＜0.05)，表明tff3、sod不同劑量與外泌體聯合使用，均可以有效緩解心肌梗死程度；但d3、d5-8組的作用與msc-exo單獨使用效果類似。尤其令人驚喜的是，d4組心肌缺血面積降低尤其明顯，且與d1組相比亦顯著降低，表明10μg/kgtff3、10mg/kgsod聯合20μg/kgmsc外泌體的應用產生了對心肌梗死尤其顯著的緩解效果，該效果優于外泌體單獨給藥，優于tff3與外泌體聯合應用，且優于sod與外泌體聯合應用。表明tff3、sod聯合msc-exo可以對心機梗死產生尤其有效的緩解效果。實施例4tff3、sod聯合msc-exo對msc-exo作用下過的促進機制研究表明，msc外泌體可以降低心肌梗死動物心臟的炎癥水平，其可以用cd68陽性細胞的數量來表示，即外泌體作用效果越強，則cd68陽性細胞數量越低，心臟炎癥水平越低(arslanetal.，stemcellresearch2013)。本實施例中，將實施例3中實驗(5)的小鼠處死后，采用免疫熒光法檢測小鼠心臟中cd68陽性細胞數量的改變。將小鼠心臟采用20％蔗糖溶液脫水4h，隨后采用oct包埋并置于-80℃冰凍；將上述冰凍組織切成5μm切片，隨后采用兔抗小鼠抗cd68抗體(abcam)于4℃孵育過夜；隨后采用熒光標記的抗兔igg(abcam)于37℃孵育1h，于電鏡下觀察小鼠心臟cd68陽性細胞并分析。實驗結果如圖5所示。與d1組相比，d2組動物的cd68+細胞倍數顯著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg劑量的外泌體可以有效降低心臟炎癥；與d1組相比，d3、d4(p＜0.01)、d5、d6、d7、d8組動物cd68+細胞倍數顯著降低(d3、d5-8組p＜0.05)，表明tff3、sod不同劑量與外泌體聯合使用，均可以有效緩解心臟炎癥，但d3、d5-8組的作用與msc-exo單獨使用效果類似。尤其令人驚喜的是，d4組cd68+細胞倍數降低尤其明顯，且與d1組相比亦顯著降低(p＜0.05)，表明10μg/kgtff3、10mg/kgsod聯合20μg/kgmsc外泌體的應用對外泌體的作用產生了尤其顯著促進作用。表明tff3、sod聯合msc-exo可以對心機梗死產生尤其有效的緩解效果。以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應當理解，以上所述僅為本發明的具體實施例，并不用于限制本發明，在本發明的構想范圍內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12