一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法
【專利摘要】本發明涉及一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法。剪取成年豬皮膚，去除毛發、脂肪和污垢后于75%酒精浸泡，用PBS清洗后剪成小塊，0.25%Trypsin中4℃消化過夜；皮膚塊經DMEM高糖培養液清洗，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化、吹打后過400目細胞篩得到細胞懸液，轉入豬皮膚干細胞培養液培養；原代培養3-4天的成年豬皮膚經PBS清洗，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗、消化，輕敲平皿側壁使細胞脫落，將消化后的細胞懸液轉移至離心管，離心后棄上清將細胞重懸后傳代。本發明方法操作簡便，可重復性好，培養的成年豬干細胞表達β1-integrin和Nestin等皮膚干細胞特異蛋白，并且是堿性磷酸酶陽性。
【專利說明】一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法
【技術領域】:[0001]本發明涉及一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法，屬于生物醫學的干細胞與組織工程學【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]干細胞(stem cells，SC)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞(embryonicstem cell, ESC)和成體干細胞(somatic stem cell)。胚胎干細胞具有發育的全能性,但是它只存在于胚胎發育早期，因此其獲得性以及倫理問題限制其進一步的研究及應用。
[0003]成體干細胞雖然沒有胚胎干細胞發育全能性方面的優勢，但是其取材方便，來源廣泛，并且仍保留向多種細胞類型分化，因此成體干細胞的體外培養以及功能研究成為近年來研究的熱點。皮膚干細胞是成體干細胞的一種，是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能干細胞。這種細胞聚居于皮膚組織的基底層以及毛囊等部位，一旦需要，便可按特定發育途徑分化產生出另外一群具有有限分裂能力的細胞群，是表皮、皮脂腺和毛囊細胞更新和修復的細胞來源。對皮膚干細胞的研究有助于皮膚組織再生，毛囊及附屬器官再生及治療脫發以及畜牧業生產具有重要意義。
[0004]成年豬皮膚外側被覆堅硬毛發，內側則密布脂肪及結締組織，干細胞數量有限，因此其體外分離培養有一定的難度，并且目前國內外研究中由于對組織內成體皮膚干細胞缺乏有效的分離培養方法，阻礙了該領域研究的深入發展。如何高效獲得具有良好生物學性能的干細胞，是目前成體干細胞研究急需解決的問題。

【發明內容】
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[0005]本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種成年豬皮膚干細胞(PorcineSkin-Derived Stem Cells)體外高效分離培養的技術方法。本發明方法分離成年豬皮膚，剪掉外側毛發并分離內側脂肪，將皮膚塊剪碎消化吹打為單細胞并過400目細胞篩后，體外培養成年豬皮膚干細胞，成功獲得大量狀態良好的成年豬皮膚干細胞。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明方法按照如下步驟操作:第一步，成年豬皮膚分離與清洗:剪取成年豬皮膚，剪掉皮膚外側毛發，并用彎角鑷刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結締組織剪干凈，于75%酒精浸泡5分鐘進行滅菌處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)清洗三次除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；第二步，原代培養成年豬皮膚干細胞:皮膚塊經DMEM/F12(細胞培養液Dulbecco’ sModified Eagle Medium, F_12Nutrient Mixture)清洗，置于 0.25%Trypsin_0.04%EDTA,37 °C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，將細胞懸液過400目細胞篩，細胞懸液轉入皮膚干細胞培養液培養，以培養當天為原代，每3-4天傳代一次；第三步，傳代培養:原代培養3-4天的成年豬皮膚經磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)洗兩遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗，之后加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側壁使細胞從皿底脫落，將消化后的細胞懸液轉移至離心管，1000轉/秒離心5分鐘后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細胞培養液將細胞重懸按照I板細胞傳代為2板或者3板細胞的比例進行傳代。
[0007]本發明方法第二步所述皮膚干細胞培養液為DMEM/F12 ; 10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生長因子；40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子；1%青鏈霉素。
[0008]本發明方法建立了成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法，從有限的材料來源獲得大量的成體動物的皮膚干細胞，操作簡便，可重復性好，為成體豬皮膚干細胞體外培養及研究應用提供了技術基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0009]圖1為成年豬皮膚干細胞體外培養顯微圖。
[0010]圖2為成年豬皮膚干細胞體外增殖生長曲線圖。
[0011]圖3為成年豬皮膚干細胞的堿性磷酸酶染色圖。
[0012]圖4為成年豬皮膚干細胞進行免疫熒光組織化學染色圖。
【具體實施方式】:
[0013]下面通過附圖和具體實施例對本發明方法做進一步闡述。
[0014]實施例1、成年豬皮膚干細胞的體外分離培養
[0015]本方法中皮膚干細胞(SDSCs)來自于成年豬皮膚。
[0016]第一步，成年豬皮膚分離與清洗:剪取出欄成年母豬背部、肚皮部等部位的皮膚，剪掉皮膚外側毛發，并用彎角鑷刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結締組織盡量剪干凈，于75%酒精浸泡5分鐘進行滅菌處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)清洗三次除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin (Hyclone公司)中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；
[0017]第二步，原代培養成年豬皮膚干細胞:皮膚塊經DMEM/F12(Hycl0ne公司)清洗3遍后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)，37°C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12 (Hyclone公司)中洗I遍，將細胞懸液過400目細胞篩后轉入成體皮膚干細胞培養液培養，皮膚干細胞培養液為DMEM/F12(Hyclone公司);10%胎牛血清；2%B27 (Gibco公司)；20ng/ml表皮生長因子(EGF，Sigma公司)；40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF, Peprotech公司)；1%青鏈霉素(Hyclone公司)，以培養當天為零代，每4天傳代一次。圖1所示為成年豬皮膚干細胞體外培養顯微圖。圖1中I為過細胞篩后單細胞懸液，培養I天后細胞數目增多并開始貼壁(圖1中2)，傳代I次后成年豬皮膚干細胞完全鋪貼壁并鋪展開，呈上皮樣細胞貼壁狀態(圖1中3)。
[0018]第三步，傳代培養:將不同傳代次數的成年豬皮膚干細胞經pH7.0的PBS洗兩遍，加入 0.5ml0.25%Trypsin_0.049f)EDTA (Hyclone 公司)潤洗，之后加入
1.5ml0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側壁使細胞從皿底脫落，將消化后的細胞懸液轉移至離心管，1000轉/秒離心5分鐘后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細胞培養液將細胞重懸按照I板細胞傳代為2板或者3板細胞的比例進行傳代。在傳代過程中進行細胞計數。傳代培養1-5代成年豬皮膚干細胞數分別為:1.2X104、2.3Χ104、5.3Χ104、7.2Χ104、10.I X 10Vml0
[0019]繪制成年豬皮膚干細胞體外增殖生長曲線，得到成年豬皮膚干細胞體外增殖生長曲線如圖2所示，橫坐標表示成年豬皮膚干細胞傳代次數，縱坐標表示成年豬皮膚干細胞傳代過程中每代細胞數(I X 104)。
[0020]實施例2、成年豬皮膚干細胞的堿性磷酸酶染色
[0021]將成年豬皮膚干細胞在PBS中洗3次后，置于4%多聚甲醛(索萊寶公司)室溫固定15分鐘，同時按如下方式配置磷酸酶染色工作液:
[0022]
?性色緩沖液(鈣云天公司)3 ml
BCIP灌液(300X,碧云天公司)10 μ?
NBT 潘液(150Χ, S 云天公-> ?J)20 μ?
BCIP/NBT 染色 J '.作液3.03 ιιι!
[0023]固定結束后，PBS洗滌3次，最后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。室溫避光孵育5-30分鐘或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預期深淺。去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應。對于組織切片或細胞樣品，顯色反應終止后，如有必要可以用中性紅染色液(neutral redstaining solution)染色，以便于觀察。圖3為成年豬皮膚干細胞的堿性磷酸酶染色，顯示成年豬皮膚干細胞為堿性磷酸酶陽性(藍紫色)。
[0024]實施例3、細胞免疫熒光化學分析成年豬皮膚干細胞特定基因表達
[0025]取出傳代兩次成年豬皮膚干細胞，消化為單細胞后，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛(索來寶公司)室溫固定15分鐘。或PBS洗3遍，每遍5分鐘。用PBST(PBS+0.5%Tr it ion-100)溶液進行透化，室溫10分鐘。PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7.0)洗I遍，5分鐘。加入含10%山羊血清或馬血清(索來寶公司)的PBST(PBS+0.5%Trition-100)，室溫封閉30 — 60分鐘。棄封閉液，加入一抗(I: 200, abeam公司)稀釋于封閉液中，4°C過夜或37°C孵育2小時。I %BSA (牛血清白蛋白，索萊寶公司)的PBS洗3遍,每遍5分鐘。加入二抗(1:200,碧云天公司)稀釋于二抗稀釋液中，37°C避光放置I小時。PBS洗3遍，每遍5分鐘。加入終濃度的DAPI (碧云天公司)，室溫放置5分鐘。PBS洗3遍，每遍5分鐘。加入500μ1 PBS或PBS甘油(1:1)在熒光顯微鏡下拍照或避光保存。圖4中1-3說明SDSCs呈β rintegrin陽性并在細胞質表達，圖4中4-6說明SDSCs呈Nestin陽性并在細胞質表達。
【權利要求】
1.一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法，其特征在于按照如下步驟操作:第一步，成年豬皮膚組織分離與清洗:剪取成年豬皮膚，剪掉皮膚外側毛發，并刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結締組織剪干凈，于75%酒精浸泡進行滅菌處理，PH7.0磷酸鹽緩沖液清洗除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；第二步，原代培養成年豬皮膚干細胞:皮膚塊經DMEM/F12清洗，置于0.25%Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，并將細胞懸液過400目細胞篩，細胞懸液轉入皮膚干細胞培養液培養，以培養當天為原代，每3-4天傳代一次；第三步，傳代培養:原代培養3-4天的成年豬皮膚干細胞經pH7.0磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗，之后加入0.25%Trypsin-0.0496EDTA置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側壁使細胞從皿底脫落，將消化后的細胞懸液轉移至離心管，1000轉/秒離心后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細胞培養液將細胞重懸按照I板細胞傳代為2板或者3板細胞的比例進行傳代；其中，所述皮膚干細胞培養液為DMEM/F12 ;10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生長因子；40ng/ml堿性成纖維細胞生長因子；1%青鏈霉素。
2.根據權利要求1所述的一種成年豬皮膚干細胞體外高效分離培養的技術方法，其特征在于培養的成年 豬干細胞表達β fintegrin和Nestin皮膚干細胞特異蛋白，并且是堿性磷酸酶陽性。
【文檔編號】C12N5/071GK103468637SQ201310445509
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】孫源超, 王俊杰, 葛偉, 李蘭, 沈偉 申請人:青島農業大學