Hpv18型l2ne7e6融合蛋白基因、表達載體、方法、菌株和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種在大腸桿菌中高效表達的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的基因、表達載體、方法、菌株和用途。本發(fā)明將HPV18型L2蛋白第11-200位氨基酸的L2N蛋白、E7蛋白、E6蛋白氨基酸序列融合，設(shè)計出適于大腸桿菌表達的密碼子優(yōu)化基因，將其插入原核表達載體pET9a，獲得pET9a-HPV18L2NE7E6表達載體及其轉(zhuǎn)化菌株，表達水平占全菌的50％，純化的融合蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，能夠產(chǎn)生特異性T細胞免疫應(yīng)答，并能明顯推遲小鼠成瘤時間，有20％的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。本發(fā)明可用于預防和治療HPV18型感染及相關(guān)疾病的疫苗研發(fā)。
【專利說明】HPV18型L2NE7E6融合蛋白基因、表達載體、方法、菌株和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒(HPV)IS型L2NE7E6融合蛋白、其編碼基因、質(zhì)粒載體、制備方法及其免疫預防和治療用途。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌在世界范圍內(nèi)占女性惡性腫瘤的第二位，嚴重威脅著女性身體健康。生殖道的高危人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān),大于90%的宮頸癌病人的宮頸樣本中可以檢測到HPV-DNA，其中HPV16的檢出率最高，其它高危型別在不同地區(qū)檢出率不同，在我國位于第二位的主要為HPV18。感染HPV18主要引起宮頸腺癌，其病變組織多位于子宮頸內(nèi)口，在進行宮頸刮片篩查時不容易被檢測到，所以發(fā)現(xiàn)時腫瘤可能已長得較大，病情進展較快且容易轉(zhuǎn)移，預后較差。因此，研制HPV18型別的疫苗對預防HPV18感染及相關(guān)腫瘤的治療具有重要意義。
[0003]目前預防性疫苗已獲得了巨大的成功，其免疫策略主要集中在基于LI衣殼蛋白形成的VLP疫苗可誘導機體產(chǎn)生強而持久的高滴度中和抗體來預防感染，由Merk公司用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的HPV6、11、16、18型的VLP組成的四價疫苗Gardasi I和GSK公司用桿狀病毒與昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)的HPV16U8型VLP蛋白組成的雙價疫苗Cervarix都已上市，兩者都具有很高的免疫原性，能夠保護90%的人群免受疫苗相應(yīng)型別HPV的感染。然而這種預防性疫苗目前只能用于沒有感染過HPV的健康人群，所以在較長時間內(nèi)仍存在大量感染HPV或?qū)m頸癌患者，而且這種VLP疫苗價格昂貴，限制了其在全球特別是在發(fā)展中國家的廣泛使用。與VLP相比 ，單獨次要衣殼L2蛋白雖然所誘發(fā)的特異性中和抗體滴度比較低，但是不同型別L2蛋白的N端氨基酸序列高度保守，使其具備誘發(fā)產(chǎn)生交叉中和抗體的能力，因此L2蛋白作為HPV廣譜預防性疫苗的候選疫苗具有研發(fā)的潛力。
[0004]治療性疫苗的目標在于誘發(fā)機體產(chǎn)生強的細胞免疫應(yīng)答，將已感染HPV的細胞或已整合HPV DNA的細胞殺傷，從而控制或消除感染HPV的良性和惡性病灶，可作為HPV重度感染或相關(guān)腫瘤手術(shù)后的輔助治療。由于HPV E6、E7蛋白持續(xù)在腫瘤細胞中表達，是形成腫瘤并維持惡性特征所必需的癌蛋白，因此其成為了治療性疫苗研究的靶抗原。目前用于治療HPV16型感染的疫苗研究比較多，細胞免疫反應(yīng)在清除病毒感染中起重要作用，各種以E6、E7蛋白為靶抗原的治療性疫苗在免疫小鼠或人后，均可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性的細胞免疫反應(yīng)。然而針對HPV18型的治療性疫苗研究相對較少，僅查到用DNA作為載體的HPVl8E6蛋白能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生的特異性細胞免疫反應(yīng)，用痘苗病毒作為載體表達的HPV18E6E7融合蛋白能夠誘發(fā)免疫后的人體產(chǎn)生不同程度的特異性細胞免疫反應(yīng)。因此，有必要對HPV18型疫苗進行研究和開發(fā)。
[0005]本研究選擇將HPV18型L2N(L2蛋白的第11-200位氨基酸)、E7、E6三個蛋白融合并按大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子進行密碼優(yōu)化，然后進行原核表達，純化后的融合蛋白能誘發(fā)強的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可以中和HPV18型假病毒，同時可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生針對E6的特異性T細胞免疫反應(yīng)，并能明顯推遲小鼠成瘤時間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制，預期在未來用于人體臨床試驗中亦能表現(xiàn)出強的免疫原性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]下面詳細討論本發(fā)明各種技術(shù)方案的制備和使用，但應(yīng)該理解，本發(fā)明提供了許多適用的發(fā)明構(gòu)思，其可以體現(xiàn)在各種各樣的具體方面上。
[0007]為有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語可用于說明的具體實例的一般類別，但它們的使用不限制本發(fā)明，權(quán)利要求中所概括的除外。
[0008]除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus)；
[0009]除非另外指出，本文所述的“bp”是指堿基對(base pair)；
[0010]除非另外指出，本文所述的“ELISP0T”是指酶聯(lián)免疫斑點(Enzyme-linkedimmunospot)；
[0011 ] 除非另外指出，本文所述的“ IPTG”是指異丙基硫代-β -D半乳糖苷(Isopropylthio-β -D-galactoside)；
[0012]除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)；
[0013]除非另外指出，本文所述的“HRP”是指辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase)；
[0014]除非另外指出，本文所述的“ IFN-Y ”是指Y-干擾素(Interferon gamma)；
[0015]除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline)；
[0016]本發(fā)明旨在提供一種能簡單、經(jīng)濟、有效的制備人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的基因核苷酸序列，該基因能在大腸桿菌中獲得高效表達，表達蛋白能用于HPV18型感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的預防和治療。
[0017]具體而言，本發(fā)明的一個目的在于，提供一種人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種用于編碼前述的人乳頭瘤病毒(HPV)IS型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列。本發(fā)明的再一個目的在于，提供一種大腸桿菌表達質(zhì)粒載體。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的大腸桿菌菌株。本發(fā)明的還一個目的在于，提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的方法。
[0018]針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0019]一方面，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2N蛋白與E7蛋白、E6蛋白融合在一起的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.1D.N0.1所示的序列。本申請中，以“HPV18L2NE7E6”或“L2NE7E6”表示該融合蛋白。
[0020]另一方面，本發(fā)明提供一種用于前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列為SEQ.1D.N0.2所示的序列。
[0021]再一方面，本發(fā)明提供一種用于表達前述融合蛋白的表達載體，所述表達載體包含前述的DNA序列；優(yōu)選地，所述表達載體為原核或真核表達載體；更優(yōu)選地，所述表達載體為大腸桿菌質(zhì)粒載體。
[0022]優(yōu)選地，所述大腸桿菌質(zhì)粒載體是由前述HPV18型的L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入至質(zhì)粒pET9a的Nde I和BamH I位點間來構(gòu)建的。
[0023]優(yōu)選地，前述大腸桿菌表達質(zhì)粒載體中，所述的大腸桿菌是BL21 (DE3)。
[0024]又一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型的L2NE7E6融合蛋白的大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株含有前述的表達載體；優(yōu)選地，所述菌株為大腸桿菌；更優(yōu)選地，所述大腸桿菌選自BL21(DE3)等適宜表達pET9a的菌株。
[0025]還一方面，本發(fā)明提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0026]I)將前述的HPV18L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入大腸桿菌表達載體pET9a的Nde I和BamH I位點，構(gòu)建出重組表達載體pET9a_HPV18L2NE7E6 ；
[0027]2)用步驟I)所構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含有該重組表達載體的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導表達；
[0028]3)將步驟2)所得到的大腸桿菌離心裂解后，收獲包涵體，用8M尿素懸起，離心，取上清用鎳離子親和層析柱純化表達蛋白。
[0029]優(yōu)選地，在本發(fā)明制備前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中，所述的大腸桿菌選自BL21 (DE3)等適宜表達pET9a的菌株。 [0030]另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于治療及預防人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方法。
[0031]此外，本發(fā)明還提供了前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表達載體或前述的大腸桿菌菌株在制備用于預防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述的藥物為疫苗。
[0032]本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療HPV18型感染及相關(guān)疾病(如宮頸癌)的疫苗，所述疫苗包括前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表達載體或前述的大腸桿菌菌株。
[0033]下面根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的詳細說明:
[0034]本實驗采用基因工程技術(shù)，根據(jù)從宮頸癌患者分離測序獲得的HPV18次要衣殼蛋白L2N蛋白核苷酸序列和與早期蛋白E7、E6核苷酸序列，設(shè)計出融合蛋白HPV18L2NE7E6的氨基酸序列，然后根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子及mRNA的二級結(jié)構(gòu)綜合分析，設(shè)計出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列，經(jīng)公司合成并克隆至原核表達載體pET9a，改造基因獲得高效表達，表達水平占全菌的50%，表達蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，用動物免疫實驗評價合成基因表達蛋白的免疫原性。
[0035]本發(fā)明根據(jù)優(yōu)化密碼子的基因序列來生產(chǎn)乳頭瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白的方法包括以下步驟:
[0036]將設(shè)計的密碼子優(yōu)化HPV18L2NE7E6基因片段插入大腸桿菌表達載體pET9a的NdeI和BamH I位點，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有pET9a_HPV18L2NE7E6的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導表達；[0037]表達菌體經(jīng)離心裂解后,收獲包涵體,用8M尿素懸起,離心,取上清用鎳離子親和層析柱純化表達蛋白。
[0038]優(yōu)選地，在本發(fā)明生產(chǎn)HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中，所述的大腸桿菌是BL21(DE3) (BL2KDE3)是常用的大腸桿菌表達菌株，一般配合以強表達載體來進行目的基因的強表達)。
[0039]本發(fā)明的含有重組質(zhì)粒pET9a_HPV18L2NE7E6的大腸桿菌菌株能用于研制治療人乳頭瘤病毒18型感染和與此感染相關(guān)的疾病(如宮頸癌)藥物。
[0040]眾所周知，同一種氨基酸有幾組密碼子，生物學上將幾組密碼子代表一種氨基酸的現(xiàn)象稱為密碼子的簡并性，而簡并性主要是由于密碼子的第三個堿基發(fā)生擺動現(xiàn)象形成的，也就是說密碼子的專一性主要由前兩個堿基決定，即使第三個堿基發(fā)生突變也能翻譯出正確的氨基酸，這對于保證物種的穩(wěn)定性有一定意義；例如:G⑶，GCC, GCA, GCG均代表丙氨酸。除色氨酸和甲硫氨酸外，其他氨基酸的密碼子均多于I個(2~6個)。簡并性并不意味著密碼不完善，每個密碼子只對應(yīng)I種氨基酸。簡并性可使突變的有害影響減到最小。大部分密碼子具有簡并性，即兩個或者多個密碼子編碼同一氨基酸。簡并的密碼子通常只有第三位堿基不同，例如，GAA和GAG都編碼谷氨酰胺。如果不管密碼子的第三位為哪種核苷酸，都編碼同一種氨基酸，則稱之為四重簡并；如果第三位有四種可能的核苷酸之中的兩種，而且編碼同一種氨基酸，則稱之為二重簡并，一般第三位上兩種等價的核苷酸同為嘌呤(A/G)或者嘧啶(C/T)。只有兩種氨基酸僅由一個密碼子編碼，一個是甲硫氨酸，由AUG編碼，同時也是起始密碼子；另一個是色氨酸，由UGG編碼。遺傳密碼的這些性質(zhì)可使基因更加耐受點突變。例如，四重簡并密碼子可以容忍密碼子第三位的任何變異；二重簡并密碼子使三分之一可能的第三位的變異不影響蛋白質(zhì)序列。由于轉(zhuǎn)換變異(嘌呤變?yōu)猷堰驶蛘哙奏ぷ優(yōu)猷奏?比顛換變異(嘌呤變?yōu)猷奏せ蛘哙奏ぷ優(yōu)猷堰?的可能性更大，因此二重簡并密碼子也具有很強的對抗突變的能力。遺傳學上將基因的這種不影響氨基酸序列的突變稱為沉默突變。然而，在特定的表達菌株中`，在不改變蛋白的氨基酸序列的前提下，使用不同的密碼子對編碼蛋白的產(chǎn)量有著非常顯著的影響。因此，從多種密碼子中選擇特定的密碼子以獲得較高蛋白產(chǎn)量稱為“密碼子優(yōu)化”。對于分子量較大，即組成的氨基酸數(shù)目較多的蛋白而言，尋找及確定密碼子優(yōu)化的核苷酸序列是具有相當難度的。
[0041]本發(fā)明人從增強疫苗的免疫原性、并能在大腸桿菌中高效表達兩方面考慮:L2的主要目的是誘導體液免疫即中和抗體，同時作為前導蛋白提高E7E6蛋白的表達，因此將L2蛋白截短僅保留含有中和抗體表位的第11-200位氨基酸的L2N蛋白，進行設(shè)計研制HPV18L2NE7E6融合蛋白疫苗，以使L2N、E7、E6三個靶抗原融合后能得以高效表達(一般分子量太大，表達水平會低)，并根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子，設(shè)計出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列，然后根據(jù)設(shè)計序列合成后，將其插入原核表達載體pET9a，實驗證實改造基因獲得高效表達，表達水平占全菌的約50%，并進行了該蛋白的純化，免疫C57BL/6小鼠后，經(jīng)ELISA抗體檢測表明該蛋白在小鼠體內(nèi)誘發(fā)了強的體液免疫反應(yīng)，所產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，ELISP0T檢測免疫后的小鼠可產(chǎn)生針對HPV18型E667_75多肽較高水平的特異性T細胞免疫反應(yīng)，小鼠腫瘤模型實驗表明免疫后的小鼠能明顯推遲腫瘤形成的時間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。本發(fā)明可用于研發(fā)預防和治療性HPV18型感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的疫苗。[0042]本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點:
[0043]本發(fā)明中含有可產(chǎn)生中和抗體的HPV18型L2N蛋白，且同時含有能夠引起細胞免疫反應(yīng)的E7和E6蛋白，使用本發(fā)明的優(yōu)化基因能夠獲得高效表達，表達水平占全菌的50%，表達蛋白經(jīng)純化免疫小鼠，實驗結(jié)果表明該蛋白具有很好的免疫原性，產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，能夠產(chǎn)生針對E667_75多肽特異性的T細胞免疫反應(yīng)，并能明顯推遲小鼠腫瘤形成時間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。該優(yōu)化基因建立的HPV18L2NE7E6融合蛋白原核高效表達系統(tǒng)能用于HPV18感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的預防和治療性疫苗的中試生產(chǎn)及新藥研發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中:
[0045]圖1為本發(fā)明實施例3中所使用的PMD18-T質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖譜；
[0046]圖2為根據(jù)本發(fā)明實施例3的方法構(gòu)建的重組原核克隆質(zhì)粒pMD18-HPV18L2NE7E6的結(jié)構(gòu)簡圖；
[0047]圖3為本發(fā)明實施例3中所使用的pET9a質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖譜；
[0048]圖4為根據(jù)本發(fā)明實施例3的方法構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒pET9a_HPV18L2NE7E6的結(jié)構(gòu)簡圖；
[0049]圖5為HPV18L2NE7E6融合蛋白原核表達SDS-PAGE，電泳結(jié)果具體為根據(jù)本發(fā)明實施例4進行的在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果；其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker, I為空載體對照，2為誘導后基因表達產(chǎn)物；
[0050]圖6為HPV18L2N`E7E6融合蛋白的Western blot鑒定結(jié)果，具體為根據(jù)本發(fā)明實施例5進行的在大腸桿菌中表達蛋白的Western-blot鑒定結(jié)果；其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker, I為空載體對照,2為誘導后基因表達產(chǎn)物；
[0051]圖7為純化后的HPV18L2NE7E6融合蛋白SDS-PAGE純度分析，具體為根據(jù)本發(fā)明實施例6進行的在原核系統(tǒng)表達經(jīng)鎳離子親和層析純化后的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果，其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker，I為純化后的HPV18L2NE7E6蛋白；
[0052]圖8為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的體液免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實施例7進行的表達蛋白經(jīng)純化，免疫小鼠后的總抗體滴度檢測的結(jié)果；
[0053]圖9為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的細胞免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實施例7進行的表達蛋白經(jīng)純化，免疫小鼠后的酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)檢測結(jié)果。
[0054]圖10為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實施例7進行的表達蛋白經(jīng)純化，免疫移植腫瘤細胞的小鼠后觀察腫瘤生長情況。
【具體實施方式】
[0055]以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0056]下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0057]實施例1:設(shè)計人乳頭瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白大腸桿菌表達的優(yōu)化密碼子基因序列
[0058]首先將從宮頸癌患者分離測序獲得的HPV18序列與Genebank中序列比對，其與AY262282 —致，然后將次要衣殼蛋白L2N蛋白的核苷酸序列與早期蛋白E7、E6核苷酸序列融合，并去掉E7、E6蛋白的起始密碼子和E7的終止密碼子，同時考慮到E7、E6蛋白為HPV18型的癌蛋白，出于對疫苗的安全性考慮，將其與致癌位點相關(guān)的氨基酸進行突變，分別是將E7蛋白第27位的Cys和第29位的Glu突變?yōu)镚ly，E6第65位氨基酸由Cys突變?yōu)镚ly，設(shè)計出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的氨基酸序列，得到具體如SEQ ID NO:1所示的融合蛋白(融合蛋白從N — C端依次為L2N、E7、E6，共451個氨基酸)。
[0059]利用基因簡并性，在其編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列保持不變的前提下設(shè)計出優(yōu)化密碼子核苷酸序列，發(fā)明人將該序列命名為HPV18L2NE7E6，經(jīng)實驗檢測證明，此序列適于在大腸桿菌中表達HPV18L2NE7E6融合蛋白，其序列具體如SEQ ID NO:2所示。
[0060]實施例2:合成密碼子優(yōu)化的基因序列，并構(gòu)建含18L2NE7E6目的基因片段的克隆質(zhì)粒
[0061]由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成質(zhì)粒pGH-18-33，該質(zhì)粒含有根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子設(shè)計的HPV18L2蛋白的第1-600位核苷酸基因片段，先用PCR方法增出L2N蛋白的基因片段，其中上游引物Pl:L2F中含有6個組氨酸并同時含有Nde I酶切位點，下游引物P2:L2R中含有BamH I酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(引物具體序列如表1所示)。然后將擴增的PCR片段插入克隆載體pMDlS-Τ中構(gòu)建出PMD18-HPV18L2N,經(jīng)測序證實HPV18L2N基因序列與設(shè)計序列相符。HPV18L2N具體序列如下: [0062]
【權(quán)利要求】
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)18L2NE7E6融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ.1D.N0.1所示的序列。
2.一種用于編碼權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示的序列。
3.一種用于表達權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達載體，其特征在于，所述表達載體含有權(quán)利要求2所述的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于表達權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達載體，其特征在于，所述表達載體為原核或真核表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于表達權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達載體，其特征在于，所述表達載體為大腸桿菌質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的表達載體，其特征在于，所述大腸桿菌質(zhì)粒載體是由權(quán)利要求2所述的DNA序列插入至質(zhì)粒pET9a的NdeI和BamH I位點間來構(gòu)建的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體，其特征在于，所述大腸桿菌BL21(DE3)。
8.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述融合蛋白的菌株，其特征在于，所述菌株含有權(quán)利要求3至7中任一項所述的表達載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述融合蛋白的菌株，其特征在于所述菌株為大腸桿菌BL21(DE3)。
10.一種制備權(quán)利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求2所述的DNA`序列插入至質(zhì)粒pET9a的NdeI和BamHI，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒 pET9a-HPV18L2NE7E6 ； 2)用步驟I)所構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得含有該重組表達質(zhì)粒的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導表達； 3)將步驟2)所得到的大腸桿菌離心裂解后，收獲包涵體，用SM尿素懸起，離心，取上清用鎳離子親和層析柱純化表達蛋白。
11.一種制備用于預防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求2所述的DNA序列、權(quán)利要求3至7中任一項所述的表達載體、權(quán)利要求8至9所述的菌株用于表達權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白。
12.權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白、權(quán)利要求2所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、權(quán)利要求3至7任一項所述的表達載體、或權(quán)利要求8-9任一項所述的菌株在制備用于預防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)的藥物中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。
13.一種用于預防和治療宮頸癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權(quán)利要求1所述的融合蛋白、權(quán)利要求2所述的DNA序列、3至7任一項所述的表達載體、或權(quán)利要求8-9任一項所述的菌株。
【文檔編號】C12N1/21GK103864936SQ201210528408
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】田厚文, 趙莉, 任皎, 馮靖, 龐正, 阮力, 譚文杰 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所