一株含有刺激植物響應蛋白Epl1基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法
【專利摘要】一株含有刺激植物響應蛋白Epl1基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法，它涉及一株含有刺激植物響應蛋白Epl1基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法。本發明一株含有刺激植物響應蛋白Epl1基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epl1為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧菌，菌落呈圓形、光滑、無色、透明。構建方法為：一、提取深綠木霉的菌絲體cDNA；二、原核表達載體pGEX-Epl1的構建；三、大腸桿菌轉化，即完成。本發明的大腸桿菌工程菌在其發酵性能不受影響的情況下，重組蛋白rEpl1誘導后對山新楊的水楊酸、茉莉酸和生長素信號傳遞途徑相關基因表達有明顯激發作用，而且生產工藝簡單，成本低廉。本發明應用于農學領域。
【專利說明】一株含有刺激植物響應蛋白EpM基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法。
【背景技術】
[0002]很多研究發現植物真菌病害生物防治菌深綠木霉(Trichoderma atroviride)能激發植物本身的防御系統而使植物能夠抵御病原菌的侵害，即誘導植物產生抗病性，從而促進植物的生長。木霉菌誘導植物抗病性機制是對植物免疫能力的整體提升，而競爭、重寄生、抗生機制是植物病害生物防治菌與病原微生物單一的作用過程。系統獲得抗性(Systemic acquired resistance, SAR)和誘導系統抗性(Induced systemic resistance,ISR)是誘導抗性的兩種形式。SAR指植物由壞死性病原物侵染或者局部組織經化學誘導物處理后，導致植物對后續多種病原物侵染產生的廣譜、持久和系統的抗性，主要通過水楊酸(Salicylic acid，SA)信號傳遞途徑激活；ISR指生物或非生物因子作用于宿主植物后，激活了該植物自身的物理或化學屏障，從而產生系統抗性的過程，茉莉酸(Jasmonic acid,JA)是ISR的一個重要信號傳遞途徑。許多研究發現，深綠木霉ACCC30153中分泌的刺激植物響應蛋白Epll (Eliciting plant response proteinl)是一種小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，屬于cerato-platanin家族,含有4個半胱氨酸殘基組成2個二硫鍵，N端存在分泌信號肽，具有疏水性，無毒，該蛋白無任何酶活性，卻具有較高的刺激植物響應的作用，能夠誘導植物產生抗性，同時還能促進植物生長。但是，深綠木霉菌絲體發酵后產生的蛋白及代謝產物較多，很難直接分離Epll蛋白，工作量大、成本較高。

【發明內容】

`[0003]本發明的目的是要解決深綠木霉菌絲體發酵后產生的蛋白及代謝產物較多，很難直接分離Epll蛋白，工作量大、成本較高的問題，提供了一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌及其構建方法。
[0004]本發明一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21_Epll為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧菌，菌落呈圓形、光滑、無色、透明。
[0005]本發明一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，是通過以下步驟進行的:
[0006]一、提取深綠木霉的菌絲體cDNA:在28°C，200轉/分鐘的條件下，將深綠木霉菌絲體在1/4H)培養基中培養48h，收集菌絲體，然后提取總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA ；
[0007]二、原核表達載體pGEX-Epll的構建:以步驟一得到的深綠木霉的菌絲體cDNA為模板，Eple和Ep2e為引物進行PCR擴增和純化，得到PCR產物；再從大腸桿菌T0P10-pGEX-4T-2中提取質粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分別對質粒pGEX_4T_2和PCR產物進行單酶切，回收酶切產物，再用SacI分別對酶切產物進行單酶切，獲得載體DNA質粒和DNA純化片段，將載體DNA質粒和DNA純化片段通過DNA連接酶進行連接，再通過大腸桿菌TOPlO感受態細胞進行轉化后得到重組載體pGEX-Epll，其中DNA連接酶為T4DNA Ligase ；
[0008]三、大腸桿菌轉化:將步驟二得到的重組載體pGEX-Epll轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，然后置于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基中，在37°C的條件下倒置培養12h后得到含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll單菌落，即完成含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建。
[0009]本發明的含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌在其發酵性能不受影響的情況下，重組蛋白rEpll誘導后對山新楊(Populus dividianaXP.bolleana)的水楊酸、茉莉酸和生長素信號傳遞途徑相關基因表達有明顯激發作用，而且能引起山新楊生理酶活性的顯著變化。因此，重組蛋白rEpll不僅能誘發山新楊產生抗性，提升山新楊防御能力，還能有效促進山新楊生長。篩選得到的大腸桿菌工程菌BL21-Epll能高效表達Epll蛋白，且對發酵設備及條件沒有特殊要求，生產工藝簡單，成本低廉，因而有廣泛的應用前景，能為林區帶來顯著經濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為試驗I步驟一中Epll基因PCR產物的電泳圖；
[0011]圖2為試驗I步驟二中重組載體pGEX-Epll的PCR檢測的電泳圖，M為DNA markerDL2000 ;1~3為重組載體pGEX-Epll的目的基因PCR產物；
[0012]圖3為試驗I步驟二中重組載體pGEX-Epll的酶切檢測的電泳圖，其中M為DNAmarker DL2000 ;1~3 為重組載體pGEX-Epll的酶切產物；4為空載體pGEX_4T_2的酶切產物；
[0013]圖4為試驗I步驟三中含氨芐青霉素LB固體培養基上篩選轉化子的圖片；
[0014]圖5為試驗2步驟一中重組菌株BL21-Ep 11表達蛋白電泳圖，其中M:蛋白Marker ；
I~4為分別誘導2、3、4、5h后的轉化子細胞中蛋白條帶；5，6為分別誘導3、5h后的轉化子發酵液中蛋白條帶為對照；箭頭為目的蛋白位置；
[0015]圖6為試驗2步驟一中純化后的rEpll蛋白電泳圖，M:蛋白Marker ；1:純化后的rEpll蛋白條帶；箭頭為目的蛋白位置；
[0016]圖7為試驗2步驟三中水楊酸信號傳遞路徑；
[0017]圖8為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后水楊酸信號路徑NPRl基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0018]圖9為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后水楊酸信號路徑PRl基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0019]圖10為試驗2步驟三中茉莉酸信號傳遞路徑；
[0020]圖11為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后茉莉酸信號路徑JARl基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0021]圖12為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后茉莉酸信號路徑COI基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0022]圖13為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后茉莉酸信號路徑JAZ基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；[0023]圖14為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后茉莉酸信號路徑MYC2基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0024]圖15為試驗2步驟三中生長素信號傳遞路徑；
[0025]圖16為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑AUXl基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0026]圖17為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑LAX2基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0027]圖18為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑TIRl基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0028]圖19為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑IAA8基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0029]圖20為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑MP基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達；
[0030]圖21為試驗2步驟三中重組蛋白rEpll誘導后生長素信號路徑GH3基因的表達的圖片，其中?為rEpll蛋白誘導山新楊的基因表達，X為對照誘導山新楊的基因表達。
【具體實施方式】
[0031]【具體實施方式】一:本實施方式一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧菌，菌落呈圓形、光滑、無色、透明。
[0032]本實施方式的含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌在其發酵性能不受影響的情況下，重組蛋白rEpll誘導后對山新楊(Populus dividianaXP.bolleana)的水楊酸、茉莉酸和生長素信號傳遞途徑相關基因表達有明顯激發作用，而且能引起山新楊生理酶活性的顯著變化。因此，重組蛋白rEpll不僅能誘發山新楊產生抗性，提升山新楊防御能力，還能有效促進山新楊生長。
[0033]【具體實施方式】二:本實施方式一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，是通過以下步驟進行的:
[0034]一、提取深綠木霉的菌絲體cDNA:在28°C，200轉/分鐘的條件下，將深綠木霉菌絲體在1/4H)培養基中培養48h，收集菌絲體，然后提取總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA ；
[0035]二、原核表達載體pGEX-Epll的構建:以步驟一得到的深綠木霉的菌絲體cDNA為模板，Eple和Ep2e為引物進行PCR擴增和純化，得到PCR產物；再從大腸桿菌T0P10-pGEX-4T-2中提取質粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分別對質粒pGEX_4T_2和PCR產物進行單酶切，回收酶切產物，再用SacI分別對酶切產物進行單酶切，獲得載體DNA質粒和DNA純化片段，將載體DNA質粒和DNA純化片段通過DNA連接酶進行連接，再通過大腸桿菌T0P10感受態細胞進行轉化后得到重組載體pGEX-Epll，其中DNA連接酶為T4DNA Ligase ；
[0036]三、大腸桿菌轉化:將步驟二得到的重組載體pGEX-Epll轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，然后置于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基中，在37°C的條件下倒置培養12h后得到含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll單菌落，即完成含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建。
[0037]本實施方式中的深綠 木霉購 買自中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為ACCC30153 ;大腸桿菌T0P10-pGEX-4T-2、大腸桿菌TOPlO感受態細胞和大腸桿菌BL21感受態細胞為購買得到。
[0038]本實施方式中1/4H)培養基的配方為馬鈴薯50g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL。
[0039]本實施方式得到的大腸桿菌工程菌BL21_Epll能高效表達EplI蛋白，且對發酵設備及條件沒有特殊要求，生產工藝簡單，成本低廉，因而有廣泛的應用前景，能為林區帶來顯著經濟效益。
[0040]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】二不同的是:步驟二所述的PCR擴增的反應體系為:10Xbuf?er2μL，dNTP0.8μL，模板2μL，引物EplelμL，引物Ep2elμL，去離子水12.8 μ L，EXTaq0.4 μ L,總體積20 μ L。反應程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58 V退火40s，72 V延伸80s，35個循環；72 V補平20min，4°C下保存，其中模板為cDNA，引物Eple和引物Ep2e的濃度為20 μ M。其它與【具體實施方式】二相同。
[0041]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】二或三不同的是:步驟二所述的酶切的體系為:第一次BamHI酶切反應體系為10Xbuffer2 μ L，BamHI酶I μ L，濃度為
0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L，去離子水7 μ L，總體積20 μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收試劑盒回收，回收產物進行第二次酶切；第二次SacI酶切反應體系為IOXbufferfy L，SacI酶1.5 μ L,濃度為0.1 μ g/μ L的目的片段15 μ L,去離子水10.5 μ L,總體積30 μ L,37°C酶切12h。其它與【具體實施方式】二或三相同。
[0042]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】二至四之一不同的是:步驟二所述的連接體系為:T4buf f er I μ L，膠回收DNA純化片段4.5 μ L，載體DNA質粒3.5 μ L，T4DNALigaselyL，共10yL，16°C連接12~16h。其它與【具體實施方式】二至四之一相同。
[0043]通過以下試驗驗證本發明的有益效果:
[0044]試驗1、本試驗一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法是通過以下步驟進行的
[0045]一、生物信息學分析:提取深綠木霉的菌絲體cDNA:在280C，200轉/分鐘的條件下，將深綠木霉菌絲體在1/4H)培養基中培養48h，收集菌絲體，然后提取DNA及總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA ;利用PCR技術克隆刺激植物響應蛋白Epll基因片段，引物為Eplc和 Ep2c ；
[0046]二、原核表達載體pGEX-Epll的構建:以步驟一得到的深綠木霉的菌絲體cDNA為模板，Eple和Ep2e為引物進行PCR擴增和純化，得到PCR產物；再從大腸桿菌T0P10-pGEX-4T-2中提取質粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分別對質粒pGEX_4T_2和PCR產物進行單酶切，分別回收兩次酶切的產物，再用SacI分別對兩次酶切產物進行單酶切，獲得載體DNA質粒和DNA純化片段，將載體DNA質粒和DNA純化片段通過DNA連接酶進行連接，再通過大腸桿菌T0P10感受態細胞進行轉化后得到重組載體pGEX-Epll，其中DNA連接酶為 T4DNA Ligase ；
[0047]其中PCR 擴增的反應體系為:10Xbuffer2y L，dNTP0.8 μ L，模板(DNA 或 cDNA)
2μ L，引物 Eple (20 μ Μ) lyLj|*Ep2e (20 μ Μ) I μ L，去離子水 12.8 μ L, EXTaq0.4 μ L,總體積20 μ L。反應程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸80s，35個循環；72°C補平20min，4°C下保存。酶切的體系為:第一次BamHI酶切反應體系為10Xbuffer2y L, BamHI酶1μ L，濃度為0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L，去離子水7 μ L，總體積20yL，37°C酶切12h之后用酶切回收試劑盒回收，回收產物進行第二次酶切。第二次SacI酶切反應體系為10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，濃度為0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去離子水10.5 μ L，總體積30μ L，37°C酶切12h。
[0048]三、大腸桿菌轉化:將步驟二得到的重組載體pGEX-Epll轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，然后置于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基中，在37°C的條件下倒置培養12h后得到含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll單菌落，即完成含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建。
[0049]本試驗中的深綠木霉購買自中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為ACCC30153 ;大腸桿菌T0P10-pGEX-4T-2、大腸桿菌T0P10感受態細胞和大腸桿菌BL21感受態細胞為購買得到。
[0050]本試驗的引物信息如表1所示。
[0051 ]本試驗步驟一中 PCR 反應體系:10 X EXbuffer2 μ L, dNTP0.8 μ L，模板(DNA或 cDNA)2yL，引物 Epic (20 μ Μ) I μ L,引物 Ep2c (20 μ Μ) I μ L，去離子水 12.8μ L,EXTaq0.4 μ L,總體積20 μ L0反應程序:94 °C預變性5min ;94°C變性30s，55 °C退火40s，72°C延伸80s，35個循環；72°C補平20min，4°C下保存。步驟一中利用PCR技術克隆Epll基因，Epll基因的cDNA和DNA序列擴增條帶分別為417bp和487bp(見圖l)，GenBank的接受號分別為JN695780和JN695781，預測編碼138個氨基酸序列，蛋白分子量大小為14.3kDa。
[0052]步驟二重組載體pGEX-Epll的PCR和酶切檢測，結果如圖2和3，產物大小約為417bp，均呈陽性，證明轉化成功，其中PCR反應體系:10Xbuffer2 μ L，dNTP0.8 μ L，模板(DNA 或 cDNA)2y L，引物 Eple (20 μ Μ) I μ L，引物 Ep2e (20 μ Μ) I μ L，去離子水 12.8μ L,EXTaq0.4 μ L,總體積20 μ L0反應程序:94 °C預變性5min ;94°C變性30s，58。。退火40s，72°C延伸80s，35個循環；72°C補平20min，4°C下保存。酶切體系:第一次BamHI酶切反應體系為10Xbuffer2 μ L, BamHI酶I μ `L,濃度為0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L,去離子水7 μ L，總體積20μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收試劑盒回收，回收產物進行第二次酶切；第二次SacI酶切反應體系為10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，濃度為0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去離子水10.5 μ L，總體積30μ L，37°C酶切12h。
[0053]表1
[0054]
引物序列_
Ep I c ATGC A ATTGTCC A ACCTCTTCEp2c CTAGAGGCCGCAGTTGCTCA
Eple ATCGGGATCCTGATACGGTCTCCTACGACAC (戈丨J線為 BamRl 酶切位點)
Cp2e CGATGAGCTCGAGGCCGCAGTTGCTCACGGC (劃線為 SacX 1? 位點)
[0055]本試驗得到的含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21_Epll單菌落如圖4所示，重組大腸桿菌工程菌BL21-Epll為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧菌，單菌落較小(Imm左右)、圓形、光滑、無色、透明。挑取單菌落置于含50 μ g/mL氨節青霉素的LB液體培養基中，在37°C，200轉/分鐘的條件下，過夜培養，對菌液進行PCR檢測，結果為陽性，證明轉化成功，其中PCR體系同步驟二。
[0056]試驗2、對試驗I得到的含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll進行驗證:
[0057]一、重組蛋白rEpll的誘導表達及純化
[0058]大腸桿菌工程菌BL21_Epll單菌落在LB液體培養基中37°C培養，當菌液濃度達到 0D_=0.5 時利用 LOmM IPTG (Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside,異丙基-β -D-硫代半乳糖)進行誘導，誘導溫度30°C，誘導轉速180~200轉/分鐘，每Ih取ImL發酵液進行 15%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)檢測，以轉化空載體pGEX_4T_2的重組菌株作為對照，結果如圖5所示，箭頭所指條帶即為重組菌株表達的重組Epll蛋白，其分子量為40.3kD左右。圖5也顯示分別培養4h和5h的重組菌株產生的重組蛋白Epll明顯比培養2h和3h含量多，并確定重組蛋白培養條件為溫度30°C培養時間4h。對培養4h的重組蛋白進行純化后獲得rEpll蛋白，15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果如圖6，分子量為40.3kDa左右。一般構建成功的重組載體，目的片段都連接到PGEX-4T-2表達載體N端的GST標簽(GlutathioneS-transferase,谷胱甘肽轉移酶),誘導大腸桿菌轉化子時,GST標簽也表達蛋白，分子量大小為26kDa，但不影響蛋白的誘導活性，因此，目的蛋白分子量大小為14.3kDa，與預期理論值相符。
[0059]二、大腸桿菌工程菌BL21_Epll的發酵
[0060]發酵培養基為LB液體培養基；誘導劑為1.0mM IPTG ;發酵生產工藝為pH7.0、溫度為30°C、轉速180~200轉/分鐘、通風量1.0~1.5 (體積/體積)、發酵時間4h。IL容量瓶IOOmL培養基培養4h能夠產生rEpll蛋白0.75mg/ml，30L小試發酵罐能發酵20L發酵液4h能產生rEpll蛋白約15g。因此，相比分離純化深綠木霉ACCC30153的天然Epll蛋白，大腸桿菌重組工程菌BL21-Epll的生產工藝更簡單高效、成本低廉。
[0061]三、重組蛋白rEpll對山新楊水楊酸、茉莉酸和生長素等激素信號的誘導
[0062]水楊酸、茉莉酸及生長素激素信號傳遞路徑相關基因的名稱如表2所示，對大腸桿菌工程菌BL21-EplI進行發酵培養，分離純化后獲得rEplI蛋白，將蛋白用大腸桿菌提取液處理后，30°C用8M尿素變性2h，在4°C下1000Orpm離心15min取上清，再加入20倍TGE萬金油(Tris Glycerol EDTA buffer)復性，取 2mL 蛋白液和 3mLl/2MS (Murashige andSkoog medium,含鹿糖20g/L和萘乙酸ΝΑΑ0.25mg/mL)液體培養基配成山新楊(PopulusdividianaXP.bolleana)誘導培養基，導入生根培養了 IOd的山新楊組培苗，對照為滅活的rEpll蛋白。分別在0、4、8、16、24和72h取山新楊的葉片提取RNA，反轉錄成cDNA，分別利用表3所示引物及內參進行RT-PCR實時熒光定量檢測山新楊水楊酸、茉莉酸及生長素等信號傳遞路徑的相關基因表達情況。RT-PCR熒光定量反應體系:2X SYBR GreenRealtime PCR Master mixlO μ L，模板(DNA或cDNA)2 μ L，上游引物(10 μ Μ)0.5 μ L，下游弓丨物(10 μ Μ)0.5 μ L,模板(cDNA)2 μ L,去離子水7 μ L,總體積20 μ L。反應程序:94°C預變性30s ;94°C變性5s，58°C退火15s，72。。延伸3s，82°C補平7s，40個循環；開始讀板，55_95°C，每間隔0.5°C讀板Is繪制溶解曲線。處理數據，制作曲線圖，分析比較各基因在誘導下的表達趨勢。
[0063] 表2水楊酸、茉莉酸及生長素等激素信號傳遞路徑相關基因的名稱
[0064]
【權利要求】
1.一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌，其特征在于含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧菌，菌落呈圓形、光滑、無色、透明。
2.如權利要求1所述的一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法是通過以下步驟進行的: 一、提取深綠木霉的菌絲體cDNA:在28°C，200轉/分鐘的條件下，將深綠木霉菌絲體在1/4H)培養基中培養48h，收集菌絲體，然后提取總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA ； 二、原核表達載體pGEX-Epll的構建:以步驟一得到的深綠木霉的菌絲體cDNA為模板，Eple和Ep2e為引物進行PCR擴增和純化，得到PCR產物；再從大腸桿菌T0P10-pGEX-4T_2中提取質粒PGEX-4T-2，然后先用BamHI分別對質粒pGEX_4T_2和PCR產物進行單酶切，回收酶切產物，再用SacI分別對酶切產物進行單酶切，獲得載體DNA質粒和DNA純化片段，將載體DNA質粒和DNA純化片段通過DNA連接酶進行連接，再通過大腸桿菌TOPlO感受態細胞進行轉化后得到重組載體pGEX-Epll，其中DNA連接酶為T4DNA Ligase ； 三、大腸桿菌轉化:將步驟二得到的重組載體pGEX-Epll轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞，然后置于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基中，在37°C的條件下倒置培養12h后得到含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌BL21-Epll單菌落，即完成含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建。
3.根據權利要求2所述的一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于步驟二所述的PCR擴增的反應體系為:IO X buffer 2 μ L，dNTP0.8 μ L，模板 2 μ L，引物 Eplel μ L，引物 Ep2el μ L，去離子水 12.8μ L, EXTaq0.4 μ L,總體積20 μ L ;反應程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸80s，35個循環；72°C補平20min，4°C下保存，其中模板為cDNA，引物Eple和引物Ep2e的濃度為20 μ Μ。
4.根據權利要求2所述的一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于步驟二所述的酶切的體系為:第一次BamHI酶切反應體系為10Xbuffer2y L, BamHI酶1μ L，濃度為0.1 μ g/μ L的目的片段10 μ L，去離子水7 μ L，總體積20μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收試劑盒回收，回收產物進行第二次酶切；第二次SacI酶切反應體系為10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，濃度為0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去離子水10.5 μ L，總體積30μ L，37°C酶切12h。
5.根據權利要求2所述的一株含有刺激植物響應蛋白Epll基因的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于步驟二所述的連接體系為:T4bufferl μ L，膠回收DNA純化片段·4.5 μ L，載體 DNA 質粒 3.5 μ L，T4DNA Ligasel μ L，共 10 μ L，16°C連接 12 ~16h。
【文檔編號】C12N15/70GK103865866SQ201410113769
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】劉志華, 遇文婧, 王志英, 刁桂萍, 張榮沭, 范海娟, 黃穎, 宋小雙 申請人:東北林業大學