蛋白IbGlu及其編碼基因與在提高甘薯莖線蟲病抗性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了蛋白IbGlu及其編碼基因與在提高甘薯莖線蟲病抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了的蛋白IbGlu，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蟲性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種IbGlu蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧透适碇校玫睫D(zhuǎn)基因甘薯植株，研究發(fā)現(xiàn)，與野生型甘薯相比，轉(zhuǎn)基因甘薯植株抗甘薯莖線蟲，說明該蛋白及其編碼基因在提高甘薯莖線蟲病抗性中具有重要的應(yīng)用價(jià)值；本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
【專利說明】蛋白IbGIu及其編碼基因與在提高甘薯莖線蟲病抗性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種蛋白IbGlu及其編碼基因與在提高甘薯莖線蟲病抗性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物在面臨多種病菌挑戰(zhàn)中，逐漸進(jìn)化形成了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制來抵抗病原菌的侵害，保護(hù)自己，減輕病害的危害程度。植物的抗病性是建立在一定的物質(zhì)基礎(chǔ)上的，是由植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等多方面因素在時(shí)間和空間上綜合表現(xiàn)的結(jié)果。它是通過體內(nèi)抗病基因的表達(dá)，進(jìn)而控制有關(guān)蛋白酶的表達(dá)和有關(guān)抗病調(diào)控物質(zhì)的廣生來實(shí)現(xiàn)的。抗病基因的存在與否，抗病基因的表達(dá)速度，有關(guān)蛋白酶的活性及調(diào)控物質(zhì)的量，就決定了植物抗病性的強(qiáng)弱。植物的主動(dòng)抗性由許多防衛(wèi)反應(yīng)組成，而且它們在時(shí)間和空間上相互交叉，并且，抗性表現(xiàn)的快慢及程度不同，其中氧爆發(fā)、一氧化氮生成、細(xì)胞壁蛋白的交聯(lián)和胼胝質(zhì)的合成與沉積是抗性中涉及的快速反應(yīng)。這些反應(yīng)不需要基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成；過敏反應(yīng)、植保素合成、木質(zhì)化、病程相關(guān)蛋白(如幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等)和富含羥脯氨酸糖蛋白的合成，以及系統(tǒng)獲得性抗性都需要基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，屬于抗性中較慢的反應(yīng)。
[0003]β -1, 3-葡聚糖酶在植物中廣泛存在，參與細(xì)胞分裂、種子萌芽、芽休眠、花的形成和果實(shí)成熟等生理分化和發(fā)育過程，并在植物病害的防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用，其生物合成受細(xì)胞分裂素、水楊酸、乙烯、病原物等誘導(dǎo)。β-1，3-葡聚糖酶可以催化大多數(shù)植物真菌細(xì)胞壁的主要 成分之一 β -1, 3-葡聚糖的水解，水解后釋放的低聚糖反過來又能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生其他多種病程相關(guān)蛋白(如植物抗毒素等)。β_1，3-葡聚糖酶屬于病程相關(guān)蛋白大家族中的一員，根據(jù)蛋白質(zhì)產(chǎn)物大小、等電點(diǎn)、一級結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位和調(diào)控模式等特征，可將其分為5類(I~V)。1、IIJII類受病原菌的誘導(dǎo)，屬于病原相關(guān)蛋白家族，I類β-1，3-葡聚糖酶是堿性液泡蛋白，II類β-1，3-葡聚糖酶是酸性胞外蛋白，與I類蛋白序列一致性為52%，III類β -1, 3-葡聚糖酶是酸性或堿性胞外蛋白，與1、II類蛋白一致性低于 57%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白IbGlu及其編碼基因。
[0005]本發(fā)明提供的蛋白IbGlu，是如下(a)或(b):
[0006](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]上述蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。[0009]編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0010]上述基因是如下(1)-(4)中任一種的DNA分子:
[0011](I)編碼序列為序列表中序列I自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子；
[0012](2)編碼序列為序列表中序列I自5’末端第49-1080位核苷酸所示的DNA分子；
[0013](3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0014](4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0015]上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0016]上述序列表中的序列I由1541個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第49-1080位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的IbGlu。
[0017]含有上述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0019]在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為載體pCB⑶S ;上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因(序列表中序列I自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子)插入pCB⑶S的Sac I和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0020]上述pCB⑶S載體是通過包括如下步驟的方法得到的:
[0021](I)將pCAMBIA1301載體(購自CAMBIA公司)經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收11786bp的載體大片段；
[0022](2)將pBI121載體(購自Clontech公司；含35S啟動(dòng)子，gusA報(bào)告基因，nos終止子片段)也經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；
[0023](3)將步驟(1)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段經(jīng)T4DNA酶連接，得到重組載體pCB⑶S。
[0024]上述pCAMBIA3301載體購自CAMBIA公司；上述pBI121載體購自Clontech公司。
[0025]擴(kuò)增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0026]上述引物對為如下I)或2):
[0027]I)由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成；
[0028]2)由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成。
[0029]上述蛋白、上述編碼基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物抗病性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0030]所述調(diào)節(jié)植物抗病性具體為提高植物抗病性；
[0031]所述病具體為線蟲病；所述線蟲病進(jìn)一步具體為甘薯莖線蟲病；
[0032]所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為甘薯。[0033]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0034]本發(fā)明提供的方法，為將上述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物。
[0035]上述方法中，所述病為線蟲病；所述線蟲病具體為甘薯莖線蟲病；
[0036]上述蛋白的編碼基因通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
[0037] 上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為甘薯。具體為甘薯品種徐薯18。
[0038]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種IbGlu蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧透适碇校玫睫D(zhuǎn)基因甘薯植株，研究發(fā)現(xiàn)，與野生型甘薯相比，轉(zhuǎn)基因甘薯植株抗甘薯莖線蟲，說明該蛋白及其編碼基因在提高甘薯莖線蟲病抗性中具有重要的應(yīng)用價(jià)值；本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株的PCR檢測結(jié)果圖
[0040]圖2為轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株塊根的室內(nèi)莖線蟲接種鑒定結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0041 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]下述實(shí)施例中甘薯品種徐薯18，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:Guo JM, Liu QC, Zhai H, Wang YP.Regeneration of plants from Ipomoeacairica L.protoplasts and production of somatic hybrids between 1.cairica Landsweetpotato, 1.batatas(L.) Lam.Plant Cell Tiss Organ Cult，2006 (87):321 - 327。
[0044]實(shí)施例1、IbGlu蛋白及其編碼基因的獲得
[0045]實(shí)驗(yàn)材料:甘薯品種魯薯3號(hào)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:翟紅，商麗麗，劉慶昌.甘薯莖線蟲誘導(dǎo)抑制差減雜交cDNA文庫的構(gòu)建及表達(dá)序列標(biāo)簽分析。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010，18 (I):141 - 148)在大田種植約90天，塊根膨大前期收獲直徑3~4cm的塊根，液氮速凍，-80° C保存。
[0046]1、塊根總RNA提取和純化
[0047]取魯薯3號(hào)薯塊2g，在液氮中研磨成粉狀，加入IOmL離心管，用Applygen植物RNA提取試劑盒(Applygen Technologies Inc, Beijing)提取甘薯塊根總RNA,試劑盒中包括:Plant RNA Reagent,植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酹；Extraction Reagent,有機(jī)抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用 QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)從總 RNA 中純化mRNA。最后，取I μ L于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，另取2 μ L稀釋至500 μ L，用紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量(OD26tl)和純度(OD26tlA)D28tl)，提取的魯薯3號(hào)的塊根總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5~2: 1，表明總RNA沒有降解，純化所得mRNA符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于甘薯IbGlu蛋白cDNA全長的克隆。
[0048]2、IbGlu蛋白cDNA的全長克隆[0049]以本實(shí)驗(yàn)室獲得的IbGlu EST片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行IbGlu蛋白cDNA的全長克隆。
[0050](1)3' -RACE
[0051 ] 以魯薯3號(hào)塊根cDNA為模板，用IbGlu EST正向引物I及Takara RNA PCRKit(AMV).3.0中的M13Primer M4引物2作為反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下:
[0052]引物1:5，TCCGCCGTTGGATTGCTC3，
[0053]引物2:5，GTTTTCCCAGTCACGAC3 ’
[0054]PCR得到的3' RACE片段，回收后連接pGEM T-Easy載體進(jìn)行TA克隆，以SP6/T7通用引物進(jìn)行測序。
[0055](2)5' -RACE
[0056]以魯薯3號(hào)塊根cDNA為模板，用IGIuEST正向引物3和正向引物4及反向引物
5、反向引物6(反向引物5、反向引物6序列參照Invitrogen5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Version2.0)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中正向引物3在引物4的下游。引物序列如下:
[0057]引物序列如下:
[0058]引物3:5，GCCGGCGGAATTGGGGTTGGGCTC3 ’
[0059]引物4:5，CGAGTAAAGGTAGGTTGTTTTGG3 ’
[0060]引物5:5，GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG3 ’
[0061]引物6:5 ’ GGCCACGCGTCGACTAGTAC3 ’
[0062]PCR得到的5' RACE片段，回收后連接pGEM T-Easy載體進(jìn)行TA克隆，以SP6/T7通用引物進(jìn)行測序。
[0063](3) PCR擴(kuò)增IbGlu蛋白cDNA的編碼區(qū)
[0064]利用DNAMAN6.0軟件拼接候選的甘薯IbGlu蛋白cDNA序列。進(jìn)一步設(shè)計(jì)正向引物7和反向引物8進(jìn)行PCR擴(kuò)增IbGlu蛋白cDNA的編碼區(qū)。引物序列如下:
[0065]引物7:5’ ATTACCTCATGGCTCTGC3’(序列 3)
[0066]引物8:5’ GCCCATTCTCTTATTCTCTG3’(序列 4)
[0067] 以魯薯3號(hào)塊根總RNA經(jīng)Oligo (dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用引物7、引物8、高保真的KOD酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為940C 5min,隨后60°C 30min和72°C 2min30s進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得1029bp長度的PCR產(chǎn)物。
[0068]經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I自5’末端第41-1188位核苷酸所示的核苷酸，該序列所示的基因命名為IbGlu，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5'端第49-1080位核苷酸；序列表中序列I由1541個(gè)堿基組成；該基因編碼的蛋白命名為IbGlu，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;序列表中序列2由343個(gè)氨基酸殘基組成。
[0069]實(shí)施例2、IbGlu蛋白在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用
[0070]一、轉(zhuǎn)IbGlu甘薯的獲得
[0071]1、重組載體pCBIbGlu的構(gòu)建
[0072]根據(jù)甘薯IbGlu蛋白cDNA的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼序列的引物序列，正反向引物分別引入BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
[0073]引物9:5，CGGGATCCATTACCTCATGGCTCTGC3，(序列 5)(下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn))，[0074]引物10:5’TTCGAGCTCGCCCATTCTCTTATTCTCTG3’(序列 6)(下劃線部分為 Sac I酶切位點(diǎn))。
[0075]以人工合成的序列表中序列I為模板，用引物9和引物10進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1165bp的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM_TEasy載體(購自北京澤平科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1360)上，命名為pGIbGlu載體，進(jìn)行T7/sp6的測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I自5’末端第41-1188位核苷酸；保證甘薯IbGlu蛋白cDNA的閱讀框及酶切位點(diǎn)的正確。
[0076]用Sac I和BamH I酶切載體pCB⑶S，回收12926bp載體大片段；同時(shí)，用Sac I和BamH I酶切載體pGIbGlu，回收約1.2kb中間片段；將回收12926bp載體大片段與約1.2kb中間片段連接，得到重組載體pCBIbGlu。
[0077]將重組載體pCBIbGlu轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶201-01)，37°C培養(yǎng)20h，進(jìn)行重組載體的PCR分析和酶切鑒定，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，重組載體PCBIbGlu為將序列表中序列I自5'端第41位-第1188位所示核苷酸插入載體PCBGUS的BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)(替換掉gusA報(bào)告基因)間得到的載體。
[0078]上述pCB⑶S載體是通過包括如下步驟的方法得到的:
[0079](I)將pCAMBIA1301載體(購自CAMBIA公司)經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收11786bp的載體大片段；
[0080](2)將pBI121載體(購自Clontech公司；含35S啟動(dòng)子，gusA報(bào)告基因，nos終止子片段)也經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；
[0081](3)將步驟(1)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段經(jīng)T4DNA酶連接，得到重組載體pCB⑶S。
[0082]2、重組載體pCBIbGlu轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0083](1)從_80°C低溫冰箱中取出200μ LEHA105感受態(tài)細(xì)胞(購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，置冰上融化，加入1 μ g上述步驟I得到的重組載體pCBIbGlu，混勻；
[0084](2)液氮冷凍 lmin,37°C溫育 5min ；
[0085](3)加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2_6h ；
[0086](4)取100 μ L菌液至LB固體培養(yǎng)基上(含100 μ g/mL利福平(Rif) >25 μ g/mL卡那霉素(Kan))，涂布均勻，將培養(yǎng)皿封口。倒置培養(yǎng)皿28°C培養(yǎng)2d ；
[0087](5)PCR鑒定呈陽性(引物9和引物10進(jìn)行擴(kuò)增，得到1165bp為陽性)的單菌落命名為 EHA105/pCBIbGlu ;將 EHA105/pCBIbGlu 接種到含有 100 μ g/mL Rif、25 μ g/mL Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)30h至對數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋30倍備用，即得到EHA105/pCBIbGlu農(nóng)桿菌菌液。
[0088]3、轉(zhuǎn)IbGlu甘薯的獲得
[0089]1)轉(zhuǎn)化
[0090]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將IbGlu cDNA的編碼序列導(dǎo)入到甘薯品種徐薯18 (以下也稱為野生型甘薯)中，具體方法如下:
[0091](1)選取經(jīng)過懸浮培養(yǎng)約3d、直徑0.7-1.3mm的甘薯品種徐薯18胚性細(xì)胞團(tuán)，懸浮于上述步驟2制備好的EHA105/pCBIbGlu農(nóng)桿菌菌液中，5min后將菌液吸出，并用含有30mg/l AS (乙酰丁香酮)和2.0mg/12, 4-D的MS液體培養(yǎng)基洗滌2次。將侵染過的胚性細(xì)胞團(tuán)接種培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基(30mg/l AS、2.0mg/12，4-D的MS)上。28°C、黑暗，共培養(yǎng)3d。
[0092]甘薯品種徐薯18胚性細(xì)胞團(tuán)的制備方法如下:
[0093]剝?nèi)￠L約0.5mm的甘薯品種徐薯18的莖尖組織(帶1_2片葉原基)，將其在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加2.0mg/L2, 4-D、3.0%蔗糖和0.8%瓊脂的MS培養(yǎng)基(pH5.8)上培養(yǎng)，在溫度為27°C、黑暗條件下培養(yǎng)8周后，將誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，該液體培養(yǎng)基除不加瓊脂外，其余成分與上述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。將三角瓶放在水平搖床上以100r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:27°C，每天13h、5001x光照，懸浮培養(yǎng)每10天繼代I次。
[0094](2)將共培養(yǎng)3d后的胚性細(xì)胞團(tuán)用含有500mg/l Carb和2.0mg/12, 4_D的MS液體培養(yǎng)基洗滌2次后，將胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)至含有2.0mg/12, 4-DU00mg/l Carb和5_20mg/l Hyg的固體MS培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27±1°C、黑暗，每2周繼代培養(yǎng)I次。經(jīng)過10-12周選擇培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)移至含有1.0mg/IABA和100mg/l Carb的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件為27±1°C、每日13h、30001x的光照。2_4周后，將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為27±1°C、每日13h、30001x的光照，4_8周后，形成完整的再生植株，得到Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株。[0095]采用同樣的方法將空載體pCBGUS轉(zhuǎn)入野生型甘薯中，得到轉(zhuǎn)空載體甘薯植株。
[0096]2)分子鑒定
[0097]用CTAB法提取Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯、轉(zhuǎn)空載體甘薯和野生型甘薯葉片的基因組DNA作為模板，用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測，所使用的IbGlu基因引物為:primer I:5 ' ATGCTTCTCCACCTCATCACC3 '和 primer2:5 ' TTGCCCAGCTATCTGTCACTT3 '。在0.2mlEppendorf 離心管中加入 IOXPCR buffer2 μ l、4dNTP(10mol/L) I μ 1、引物(10 μ mol/1)均為 I μ 1、模板 DNA (50ng/ul) 2 μ 1、Taq DNA 聚合酶 lul,加 H2O 至總體積20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性4min，60°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共36個(gè)循環(huán)。
[0098]電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖1(泳道M為Maker，泳道W為野生型甘薯植株；泳道P為陽性對照(重組質(zhì)粒pCBIbGlu);泳道C為轉(zhuǎn)空載體甘薯植株；泳道1-泳道13為Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株)，可以看出，得到1231bp的為陽性Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株，除4、7、12以外的其余Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株均為陽性Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株；表明IbGlu基因已經(jīng)整合到徐薯18的基因組中，并證明這些再生植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)空載體甘薯植株和野生型甘薯植株均沒有目的片段。
[0099]將經(jīng)鑒定為陽性的編號(hào)為1、2、3、6、10、13、14的Ttl代轉(zhuǎn)IbGlu甘薯植株擴(kuò)繁，并進(jìn)行隔離大田種植，收獲編號(hào)為1、2、3、6、10、13、14的轉(zhuǎn)IbGlu甘薯薯塊進(jìn)行莖線蟲接種鑒定。
[0100]二、轉(zhuǎn)IbGlu甘薯的抗蟲驗(yàn)證
[0101]1、轉(zhuǎn)基因植株塊根的室內(nèi)莖線蟲接種鑒定
[0102]將收獲得到的編號(hào)為1、2、3、6、10、13、14的轉(zhuǎn)IbGlu甘薯塊根進(jìn)行甘薯莖線蟲(Gao S，Yu B, Yuan L, Zhai H, He SZ, Liu QC(2011): Production of transgenicsweetpotato plants resistant to stem nematodes using oryzacystatin-1 gene.Scientia Horticulturae, 128:408-414;公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)接種，以鑒定其對甘薯莖線蟲病的抗性。以轉(zhuǎn)空載體甘薯塊根和野生型甘薯塊根為對照。
[0103]線蟲接種方法參照于波(2007)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文中的方法，具體方法如下:
[0104]( I)甘薯莖線蟲的增殖培養(yǎng)和分離
[0105]I)用淺盤法分離出線蟲，在燒杯中室溫沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，5000rpm室溫離心2min，收集線蟲，在顯微鏡下觀察線蟲口針和尾部來確認(rèn)甘薯莖線蟲。
[0106]2)用ImllOOmg F1Str消毒15min,反復(fù)輕搖使線蟲與Str充分混合接觸。
[0107]3) 5000rpm,室溫下離心2min,棄掉Str,用滅菌水清洗3次,每次5000rpm室溫下離心2min。收集的線蟲4°C滅菌水保存。
[0108]4)取10 μ I線蟲加入90 μ I水稀釋10倍，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，重復(fù)3次確定收集線蟲的濃度，以雌蟲、雄蟲和幼蟲總和作為蟲量。
[0109]5)將編號(hào)為1、2、3、6、10、13、14的轉(zhuǎn)IbGlu甘薯塊根及野生型甘薯塊根用自來水
洗凈甘薯塊根表面的泥土，然后用70%乙醇清洗塊根進(jìn)行表面消毒。每個(gè)株系各取3個(gè)塊根作為重復(fù)。
[0110]6)用打孔器在甘薯塊根中部打孔，用槍頭將500條甘薯莖線蟲注入孔中，將打孔器中的薯?xiàng)l插入孔中，用熔化的石蠟封口。25°C培養(yǎng)，30d。
[0111](2)室內(nèi)莖線蟲接種鑒定
[0112]接種培養(yǎng)30d后，沿著接種孔切開橫切面，觀察、統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)IbGlu甘薯塊根和野生型甘薯塊根的感病面積。
[0113]甘薯莖線蟲病抗性的鑒定方法參照謝逸萍等(2002)，對感病面積進(jìn)行分級，根據(jù)病情指數(shù)來確定轉(zhuǎn)基因株系的抗病性:
[0114]I)薯塊發(fā)病程度
[0115]以薯塊橫切面發(fā)病程度分級
[0116]O級:無病癥；
[0117]I級:發(fā)病面積占橫切面的25%以下；
[0118]2級:發(fā)病面積占橫切面的25%_50% ；
[0119]3級:發(fā)病面積占橫切面的50%_75% ；
[0120]4級:發(fā)病面積占橫切面的75%以上。
[0121]2)病情指數(shù)和防治效果:
[0122]病情指數(shù)和防治效果按照下列公式計(jì)算:
[0123]病情指數(shù)=[Σ (各級病塊數(shù)X相應(yīng)病級數(shù))/(調(diào)查總薯數(shù)X最高病級數(shù))]X 100%
[0124]防治效果=[(1-病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]X 100%
[0125]根據(jù)防治效果劃分其抗性如表1所示:
[0126]表1為防治效果劃分其抗性結(jié)果圖
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任一種的DNA分子: (1)編碼序列為序列表中序列I自5’末端第41-1188位核苷酸所示的DNA分子； (2)編碼序列為序列表中序列I自5’末端第49-1080位核苷酸所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物抗病性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求 4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物抗病性中的應(yīng)用； 所述病具體為線蟲病；所述線蟲病進(jìn)一步具體為甘薯莖線蟲病； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述病為線蟲病；所述線蟲病具體為甘薯莖線蟲病； 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因通過權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103897048SQ201210585394
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】翟紅, 劉慶昌, 何紹貞, 王飛兵 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)