專利名稱：一種大豆光合作用相關基因GmDeg1及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種大豆光合作用相關基因GmDegl及其應用。
背景技術：
光合作用是生物界賴以生存的源泉和基礎，然而在強光下，植物光合功能易受到抑制，光合機構遭到破壞，從而降低了光合效率，這個過程稱為光抑制。在長期進化過程中植物體形成了多種保護其免受強光破壞的生物物理和生物化學機制，來靈活地抵御復雜多變的光照脅迫，以將光抑制傷害減小到最低程度。除一些形態上的適應外，光合機構還存在熱耗散、光呼吸和Dl蛋白的周轉等幾種保護機制。光破壞的主要目標是PSII核心蛋白中的Dl蛋白，損傷后的Dl蛋白會影響到電子傳遞等功能和PSII反應中心結構的變化，導致光合功能的降低。損傷的Dl蛋白被蛋白酶降解后由新合成的Dl蛋白填補上繼而完成正常 的生理功能。Deg蛋白酶家族屬于絲氨酸類蛋白酶,迄今為止的研究表明擬南芥中有5個Deg蛋白酶家族成員，定位于葉綠體中，并已證明在Dl蛋白的周轉過程中發揮著重要作用。大豆作為重要的經濟作物，是當今世界上最重要的植物蛋白與食用植物油的來源，而在強光下，大豆不可避免地發生光抑制現象，從而導致大豆產量和品質的下降。因而對于光抑制機制和光保護機制的研究對大豆產量和品質的提高具有重要意義。Krause (1988)和Oquist (1992)指出，PSII活性的下調可以耗散過剩的激發能，是一種避免PSII反應中心遭受強光破壞的保護機制,這已被大量研究所證實(Krause,1991)。對于PSII活性下調的原因，首先由Guenther和Melis (1990)提出是由于Dl蛋白降解與合成修復循環運轉造成的。但后來研究表明，用葉綠體蛋白合成抑制劑林肯霉素處理，對Dl蛋白水平和光抑制的恢復都沒有影響，因此Aro (1993)提出PSII光化學活性的降低是PSII中心可逆失活的結果。Anderson (1994)研究指出失活的PSII可以聚集在類囊體膜的垛疊區，發生Dl蛋白的磷酸化，從而避免了 Dl蛋白的降解。然而目前對PSII反應中心活性的降低如何轉變激發能為熱耗散的機理仍不清楚。到目前為止，在大豆中，Deg基因家族還未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種大豆光合作用相關基因GmDegl。本發明的另一目的是提供該基因編碼的蛋白。本發明的又一目的是提供該基因的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現—種大丑光合作用相關基因GmDegl,核苷酸序列如SEQ ID NO. I所不。本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl編碼的蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。一種含有本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒。
本發明所述的重組質粒，其特征在于將本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl插入pMDC83植物過量表達載體中。本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl在大豆抗光抑制作用中的應用。本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl在培育高光效大豆品種中的應用。含本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒在大豆抗光抑制作用中的應用。含本發明所述的大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒在培育高光效大豆品種中的應用。有益效果
本發明所提供的大豆光合作用相關基因GmDegl，位于第19條染色體上，讀碼框長度為1296bp。其編碼的蛋白具有典型的催化三聯基(Ser、His、Asp)，屬于不依賴于ATP的絲氨酸類蛋白酶。蛋白酶定位于類囊體腔側，對底物要求比較高。序列中存在PDZ結構域，其通過與底物蛋白C-末端的氨基酸殘基發生特異性的結合從而起到識別底物和調節蛋白酶活性的作用。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明GmDegl基因導入植物細胞，可獲得對光抑制抵抗能力得到提高的轉基因植株。使用本發明的基因構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素、卡那霉素等)。攜帶有本發明GmDegl的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對大豆抗光抑制作用，特別是培育高光效大豆品種具有重要意義。


圖I大豆GmDegl基因的克隆。圖2大豆GmDegl基因的表達分析。注用1^處理大豆幼苗，分別于011、111、311、611和1此探索基因表達量的變化。數值以3個重復的平均值土標準差形式表示。圖3大豆GmDegl基因在大腸桿菌中的表達分析。注A圖.含有pET28a-GmDegl質粒的BL21 (DE3)菌液經ImM IPTG誘導6h，過量表達的蛋白經NI-NTA柱純化。陰性對照I、陰性對照2、S、P、FL、E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7分別表示含有空載pET28a的BL21 (DE3)、不含質粒的BL21 (DE3)、超聲后上清、超聲后沉淀、穿流液、20mM咪唑洗脫液、20mM咪唑洗脫液、40mM咪唑洗脫液、40mM咪唑洗脫液、IOOmM咪唑洗脫液、250mM咪唑洗脫液和250mM咪唑洗脫液。SDS-PAGE電泳檢測樣品后，考馬斯亮藍R250染色。B圖.Western blot分析(A圖)中的組分,一抗為anti-His抗體。圖4GmDegl對β -酪蛋白的降解活性。注A1.8yg GmDegl和50 μ gP-酪蛋白混合，在37°C和pH 6. O條件下反應2h，分時段取樣SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色。A2. 8 μ g GmDegl 和 50yg@-酪蛋白混合，加入 PMSF 至終濃度 lmM，37°C 和 pH 6. O條件下反應2h，分時段取樣SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色。A3. 8 μ g GmDegl和50 μ g β -酪蛋白混合,在pH 6. O和不同的溫度條件下反應lh,SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色。A4. 8 μ g GmDegl和50 μ g β _酪蛋白混合,在37°C和不同的pH條件下反應lh,SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色。圖5大豆GmDegl基因的植物過量表達載體構建流程。圖6轉基因苗的篩選和檢測。注在含有潮霉素的LB平板上篩選Ttl代種子，結果如A圖，紅圈表示陽性植株。為得到純合系轉基因植株，繁殖至T3代，潮霉素篩選結果如B圖，對T3代植株分別用四對引物PCR檢測，結果如C圖。圖7強光下轉基因和野生型植株的PSII活性。注離體葉片在1000 μ mo I · m2 · s_1的光照下照射，在0h、0. 5h、lh、2h和4h測PSII的最大光化學效率(Fv/Fm)，4h后降低光強為80 μ mo I · m_2 · s—^h后測Fv/Fm, A圖為轉GmDegl植株浮于水上測得的結果，B圖為轉GmDegl植株浮于林可霉素溶液上測得的結果。數值以3個重復的平均值土標準差的形式表示。
具體實施例方式實施例I、大豆GmDegl基因的克隆用植物總RNA提取試劑盒(購自天根公司)提取大豆品種科豐I號葉片總RNAj^1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成按照TaKaRa公司SYBR PrimeScriptRT-PCR Kit II試劑盒說明操作。設計引物GmDegl-F :5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCAACCAAAAACAATGGCCAC-3’(SEQ ID NO. 3)GmDegl-R :5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGATTCATCAGGCTTTGGCTCC-3’(SEQ ID NO. 4) 按照以下組份順序配制PCR反應液(50 μ I體系)
10XPCR Buffer5 μ I
ddH,034. 75 μ I
dNTP (2. 5 mM)4 μ I
Mg2. (25 mM)3 μ I
上游引物 GmDegH (10 raM)I μ I
下游引物 GmDegH (10 mM)I μ I
cDNAI μ I
Taq 酶(5 υ/μ I)O. 25 μ I
按以下程序進行PCR反應
權利要求
1.一種大豆光合作用相關基因GmDegl，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.權利要求I所述的大豆光合作用相關基因GmDegl編碼的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權利要求I所述的大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒。
4.根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于將權利要求I所述的大豆光合作用相關基因GmDegl插入pMDC83植物過量表達載體中。
5.權利要求I所述的大豆光合作用相關基因GmDegl在大豆抗光抑制作用中的應用。
6.權利要求I所述的大豆光合作用相關基因GmeDegl在培育高光效大豆品種中的應用。
7.權利要求3所述的含大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒在大豆抗光抑制作用中的應用。
8.權利要求3所述的大豆光合作用相關基因GmDegl的重組質粒在培育高光效大豆品種中的應用。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，公開了一種大豆光合作用相關基因GmDeg1及其應用。一種大豆光合作用相關基因GmDeg1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明Gmeg1基因導入植物細胞，可獲得對光抑制抵抗能力得到提高的轉基因植株。本發明的基因對大豆抗光抑制作用，特別是培育高光效大豆品種具有重要意義。
文檔編號C12N9/50GK102978225SQ20121053224
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者楊守萍, 孔星, 張璟曜 申請人:南京農業大學