專利名稱：一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸的制備方法，尤其是涉及一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法。
背景技術(shù)：
L-鳥(niǎo)氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)組成的堿性氨基酸，具有重要的活性和生理功能，其兼具有營(yíng)養(yǎng)和治療功能，在醫(yī)療保健、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，L-鳥(niǎo)氨酸的合成主要有化學(xué)合成法、化學(xué)水解法、生物酶水解法以及菌種發(fā)酵法等幾種。化學(xué)合成法主要是以丙稀醛、氰化氫、氨氣、二氧化碳等為原料進(jìn)行化學(xué)合成，該方法主要缺點(diǎn)是步驟多，收率不高，同時(shí)得到的產(chǎn)品為活性的L-鳥(niǎo)氨酸與非活性的D-鳥(niǎo) 氨酸混合物，后期分離難度大，涉及的生產(chǎn)原料劇毒，對(duì)環(huán)境不友好等，所以基本上沒(méi)有進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。化學(xué)水解法是目前國(guó)內(nèi)一些廠家所采用的普遍方法，該方法是以氫氧化鋇等堿性物質(zhì)對(duì)精氨酸進(jìn)行水解生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，該方法理論收率可達(dá)到80%左右，主要缺點(diǎn)是合成后對(duì)堿性物質(zhì)進(jìn)行分離造成污水量大，同時(shí)因?yàn)槭褂脧?qiáng)堿性物質(zhì)水解L-精氨酸的過(guò)程中，不可避免的會(huì)同時(shí)有D-鳥(niǎo)氨酸的生成，使得所得的產(chǎn)品旋光度不高，純度受到很大的限制，不能得到藥用甚至食品用純度的產(chǎn)品，所以，該方法也已經(jīng)逐步被淘汰。生物酶法是以精氨酸水解酶(EC3. 5. 3.1)對(duì)L-精氨酸進(jìn)行水解生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，是目前許多研究機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)廠家的重點(diǎn)研究對(duì)象。精氨酸水解酶水解L-精氨酸在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以達(dá)到99%以上的水解收率，并且因?yàn)槊傅亩ㄏ蛩馓匦裕沟玫絃-鳥(niǎo)氨酸最終產(chǎn)品的純度可達(dá)99%以上，光學(xué)純度幾乎沒(méi)有任何變化，能達(dá)到藥用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。在接近于100%的水解收率情況下，對(duì)于水解完畢后的產(chǎn)品分離提純也顯得非常簡(jiǎn)單便利。但因?yàn)槊冈谒馔瓿珊鬅o(wú)法回收，酶的來(lái)源及提取方式的固有問(wèn)題，使得其價(jià)格高、來(lái)源有限，正是由于這些問(wèn)題的存在，導(dǎo)致了酶法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸成本過(guò)高，產(chǎn)量受制于酶源，限制了該方法的規(guī)模化生產(chǎn)。菌種發(fā)酵法日益成為目前L-鳥(niǎo)氨酸的研究重點(diǎn)。在已經(jīng)用發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸的日本昧之素公司，也存在著菌種產(chǎn)酸率不高、后期分離難、菌種傳代差異導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定、菌種控制及生產(chǎn)控制相對(duì)比較復(fù)雜等諸多因素，導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)成本相對(duì)于化學(xué)水解法和酶水解法要高很多，產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定性，菌種的選擇與培養(yǎng)技術(shù)以及高額的設(shè)備投資，嚴(yán)重制約了這種生產(chǎn)方法推廣與普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足而提供一種收率高、能耗低，且工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定的酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于包含如下工藝步驟和工藝參數(shù)
①將樹(shù)酯與濃度為10%碳酸鈉溶液浸泡12h后，過(guò)濾，濾出的樹(shù)酯用純水洗滌，然后按樹(shù)酯碳酸鈉純水=I O. 3 O. 8 30 100質(zhì)量比配成溶液，調(diào)溶液的PH值為9 13，攪拌下降溫至彡-50C，加入固化劑保溫2h，再加入酶水溶液，升溫至O 10°C保溫10 16h，濾出樹(shù)酯，用10倍純水洗滌三次，得固定化酶樹(shù)脂；
②在反應(yīng)釜中加入去離子水，邊攪拌邊加入L-精氨酸，升溫至25 55V,得質(zhì)量濃度為300 500g / I的L-精氨酸水溶液；
③將150 250g醋酸錳加入反應(yīng)釜中，攪拌10分鐘，再將固定化酶樹(shù)脂加入反應(yīng)釜中，加入量為步驟②中L-精氨酸質(zhì)量的2 3%，對(duì)L-精氨酸水溶液進(jìn)行水解，得L-鳥(niǎo)氨酸粗品水溶液，經(jīng)過(guò)濾除酶，淋洗除去表面雜質(zhì)，得L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液；
④在L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液中加入成鹽原料，經(jīng)反應(yīng)、脫色、過(guò)濾、結(jié)晶和干燥，得到L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽。
所述步驟①中的樹(shù)酯為具有胺基基質(zhì)的大孔吸附樹(shù)酯。所述步驟①中的固化劑為溴化氰或碳酸鈉,加入量為樹(shù)酯質(zhì)量的O. 3 O. 8%。所述步驟①中的酶水溶液為濃度1%的精氨酸水解酶，加入量為樹(shù)酯質(zhì)量O. 001 O.005%。所述步驟③中的水解溫度為20 65C°，保溫時(shí)間為10 16h。所述步驟④中的成鹽原料為L(zhǎng)-天門(mén)冬氨酸或a-酮戊二酸，加入量為步驟②中L-精氨酸質(zhì)量的75 85%。本發(fā)明使用的酶是精氨酸水解酶(EC3. 5. 3. 1)，這是一種亞胺基蛋白酶，分子量在12000左右，能重復(fù)使用30次以上，再生簡(jiǎn)單。本發(fā)明針對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及其活力特性，選擇具有胺基基質(zhì)的大孔吸附樹(shù)酯，不同于普通吸附方式的是，在酶與樹(shù)酯結(jié)合固定化過(guò)程中，采用溴化氰或碳酸鈉作為固定化處理劑進(jìn)行特殊處理，使得精氨酸水解酶與大孔吸附樹(shù)酯在充分的接觸過(guò)程中，其孔內(nèi)外表面的胺基反應(yīng)形成牢固的共價(jià)結(jié)構(gòu)，再通過(guò)簡(jiǎn)單的淋洗除去表面雜質(zhì)達(dá)到固定的目的。這樣不僅具備吸附固定酶處理方便、成型容易，固載量大的特點(diǎn)，同時(shí)又具備共價(jià)固定不易脫落的特性，達(dá)到酶固定的目的，為后期連續(xù)化生產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明方法不僅保持了酶法生產(chǎn)收率高，品質(zhì)好以及質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)解決了酶法生產(chǎn)過(guò)程酶無(wú)法回收利用的問(wèn)題導(dǎo)致的使用成本高、不能連續(xù)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)，綜合效能比目前發(fā)酵法更具有優(yōu)勢(shì)，并且同時(shí)可以非常方便的達(dá)到一步法合成L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽，從而摒棄了先通過(guò)L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽經(jīng)樹(shù)酯柱處理得到游離狀態(tài)的L-鳥(niǎo)氨酸，然后再與其他氨基酸合成鹽的傳統(tǒng)復(fù)合鹽生產(chǎn)方法，使得復(fù)合鹽的生產(chǎn)過(guò)程大為簡(jiǎn)化，生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)廢水產(chǎn)生，能耗也大為下降，完全達(dá)到節(jié)能降耗的綠色生產(chǎn)目的。2、本發(fā)明采用填裝樹(shù)酯柱，進(jìn)行多級(jí)串并聯(lián)，物料配制成固定濃度后，經(jīng)過(guò)泵輸送方式，以穩(wěn)定的流速通過(guò)樹(shù)酯柱的方法進(jìn)行生產(chǎn)方式的改進(jìn)，進(jìn)行連續(xù)化不間斷生產(chǎn)，反應(yīng)底物經(jīng)過(guò)樹(shù)酯柱中酶的充分水解后，從串聯(lián)級(jí)未端流出的是最終產(chǎn)物。生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)每只樹(shù)酯柱流出產(chǎn)物濃度進(jìn)行過(guò)程監(jiān)控，對(duì)于因使用過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或其他原因?qū)е碌墓潭ɑ甘Щ畹臉?shù)酯柱及時(shí)更換方式，保證生產(chǎn)過(guò)程的不間斷生產(chǎn)。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程可完全實(shí)施電腦程序化自動(dòng)控制，改變傳統(tǒng)的生產(chǎn)模式，不僅節(jié)省了人力資源，節(jié)約了能耗，同時(shí)大幅提高了生產(chǎn)效能，并能完全保證最終產(chǎn)物的質(zhì)量，收率達(dá)93%以上。3、本發(fā)明制備方法因?yàn)槊傅母咝н\(yùn)用，終端產(chǎn)物中基本上是游離狀態(tài)的L-鳥(niǎo)氨酸，基本不存在其他的游離基質(zhì)，所以，可以根據(jù)市場(chǎng)的需要，非常方便的合成出相應(yīng)的L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽，從而避免了常規(guī)通過(guò)鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽經(jīng)樹(shù)酯交換除鹽轉(zhuǎn)化成游離鳥(niǎo)氨酸后再進(jìn)行復(fù)合鹽的傳統(tǒng)方法，徹底簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程，減少了因過(guò)柱吸附、解析所產(chǎn)生的大量含酸含氨生產(chǎn)廢水。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1 :
①將大孔吸附樹(shù)酯與濃度為10%碳酸鈉溶液浸泡12h后，過(guò)濾，濾出的樹(shù)酯用純水洗滌，然后按樹(shù)酯碳酸鈉純水=I O. 3 30質(zhì)量比配成溶液，調(diào)溶液的PH值為9，攪拌下降溫至< -5°C，緩慢滴加樹(shù)酯質(zhì)量O. 3%的碳酸鈉，保溫2h后，加入濃度為1%、質(zhì)量為樹(shù)酯質(zhì)量O. 001%的酶水溶液，升溫至0°C保溫10h，濾出樹(shù)酯，用10倍純水洗滌三次，得固定化酶樹(shù)脂；
②在2000L的反應(yīng)釜中加入去離子水1000L，邊攪拌邊加入L-精氨酸300公斤，升溫至25°C，得質(zhì)量濃度為300g / I的L-精氨酸水溶液；
③將150g醋酸錳加入反應(yīng)釜中，攪拌10分鐘后，加入固定化酶樹(shù)脂5公斤，對(duì)L-精氨酸水溶液進(jìn)行水解，水解溫度40°C，保溫時(shí)間10h，得L-鳥(niǎo)氨酸粗品水溶液，過(guò)濾濾除樹(shù)酯，得L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液；
④在L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液中加入a-酮戊二酸250公斤，升溫至60°C，保溫I小時(shí)，力口入活性炭脫色，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入5000L結(jié)晶釜中，加入濃度為95%以上的乙醇3000L，在10°C下攪拌下結(jié)晶3h，然后過(guò)濾，濾餅烘干，得L-鳥(niǎo)氨酸a-酮戊二酸復(fù)合鹽產(chǎn)品。實(shí)施例2:
①將大孔吸附樹(shù)酯與濃度為10%碳酸鈉溶液浸泡12h后，過(guò)濾，濾出的樹(shù)酯用純水洗滌，然后按樹(shù)酯碳酸鈉純水=I O. 5 60質(zhì)量比配成溶液，調(diào)溶液的PH值為11，攪拌下降溫至< _5°C，緩慢滴加樹(shù)酯質(zhì)量O. 5%的溴化氰，保溫2h后，加入濃度為1%、質(zhì)量為樹(shù)酯質(zhì)量O. 003%的酶水溶液，升溫至5°C保溫13h，濾出樹(shù)酯，用10倍純水洗滌三次，得固定化酶樹(shù)脂；
②在2000L的反應(yīng)釜中加入去離子水1000L，邊攪拌邊加入L-精氨酸400公斤，升溫至40°C，得質(zhì)量濃度為400g / I的L-精氨酸水溶液；
③將200g醋酸錳加入反應(yīng)釜中，攪拌10分鐘后，加入固定化酶樹(shù)脂8公斤，對(duì)L-精氨酸水溶液進(jìn)行水解，水解溫度50°C，保溫時(shí)間13h，得L-鳥(niǎo)氨酸粗品水溶液，過(guò)濾濾除樹(shù)酯，得L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液；
④在L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液中加入L-天門(mén)冬氨酸300公斤，升溫至60°C，保溫I小時(shí)，加入活性炭脫色，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入5000L結(jié)晶釜中，加入濃度為95%以上的乙醇3000L，在10°C下攪拌下結(jié)晶3h，然后過(guò)濾，濾餅烘干，得L-鳥(niǎo)氨酸L-天門(mén)冬氨酸復(fù)合鹽產(chǎn)品。
實(shí)施例3:
①將大孔吸附樹(shù)酯與濃度為10%碳酸鈉溶液浸泡12h后，過(guò)濾，濾出的樹(shù)酯用純水洗滌，然后按樹(shù)酯碳酸鈉純水=I 0.8 100質(zhì)量比配成溶液，調(diào)溶液的PH值為13，攪拌下降溫至< _5°C，緩慢滴加樹(shù)酯質(zhì)量O. 8%的溴化氰，保溫2h后，加入濃度為1%、質(zhì)量為樹(shù)酯質(zhì)量O. 005%的酶水溶液，升溫至10°C保溫16h，濾出樹(shù)酯，用10倍純水洗滌三次，得固定化酶樹(shù)脂；
②在2000L的反應(yīng)釜中加入去離子水1000L，邊攪拌邊加入L-精氨酸500公斤，升溫至55°C，得質(zhì)量濃度為500g / I的L-精氨酸水溶液；
③將250g醋酸錳加入反應(yīng)釜中，攪拌10分鐘后，加入 固定化酶樹(shù)脂10公斤，對(duì)L-精氨酸水溶液進(jìn)行水解，水解溫度65°C，保溫時(shí)間16h，得L-鳥(niǎo)氨酸粗品水溶液，過(guò)濾濾除樹(shù)酯，得L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液；
④在L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液中加入L-天門(mén)冬氨酸380公斤，升溫至60°C，保溫I小時(shí)，加入活性炭脫色，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入5000L結(jié)晶釜中，加入濃度為95%以上的乙醇3000L，在10°C下攪拌下結(jié)晶3h，然后過(guò)濾，濾餅烘干，得L-鳥(niǎo)氨酸L-天門(mén)冬氨酸復(fù)合鹽產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于包含如下工藝步驟和工藝參數(shù)①將樹(shù)酯與濃度為10%碳酸鈉溶液浸泡12h后，過(guò)濾，濾出的樹(shù)酯用純水洗滌，然后按樹(shù)酯碳酸鈉純水=I O. 3 O. 8 30 100質(zhì)量比配成溶液，調(diào)溶液的PH值為9 13，攪拌下降溫至彡-50C，加入固化劑保溫2h，再加入酶水溶液，升溫至O 10°C保溫10 16h，濾出樹(shù)酯，用10倍純水洗滌三次，得固定化酶樹(shù)脂；②在反應(yīng)釜中加入去離子水，邊攪拌邊加入L-精氨酸，升溫至25 55V,得質(zhì)量濃度為300 500g / I的L-精氨酸水溶液；③將150 250g醋酸錳加入反應(yīng)釜中，攪拌10分鐘，再將固定化酶樹(shù)脂加入反應(yīng)釜中，加入量為步驟②中L-精氨酸質(zhì)量的2 3%，對(duì)L-精氨酸水溶液進(jìn)行水解，得L-鳥(niǎo)氨酸粗品水溶液，經(jīng)過(guò)濾除酶，淋洗除去表面雜質(zhì)，得L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液；④在L-鳥(niǎo)氨酸游離單質(zhì)溶液中加入成鹽原料，經(jīng)反應(yīng)、脫色、過(guò)濾、結(jié)晶和干燥，得到L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于所述步驟①中的樹(shù)酯為具有胺基基質(zhì)的大孔吸附樹(shù)酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于所述步驟①中的固化劑為溴化氰或碳酸鈉，加入量為樹(shù)酯質(zhì)量的O. 3 O. 8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于所述步驟①中的酶水溶液為濃度1%的精氨酸水解酶，加入量為樹(shù)酯質(zhì)量O. 001 O. 005%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于所述步驟③中的水解溫度為20 65C°，保溫時(shí)間為10 16h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法，其特征在于所述步驟④中的成鹽原料為L(zhǎng)-天門(mén)冬氨酸或a-酮戊二酸，加入量為步驟②中L-精氨酸質(zhì)量的75 85%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酶固定化連續(xù)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽的方法。該方法選擇具有胺基基質(zhì)的大孔吸附樹(shù)酯，在酶與樹(shù)酯結(jié)合固定化過(guò)程中，采用固化劑進(jìn)行特殊處理，使得精氨酸水解酶與大孔吸附樹(shù)酯在充分的接觸過(guò)程中，其孔內(nèi)外表面的胺基反應(yīng)形成牢固的共價(jià)結(jié)構(gòu)，再通過(guò)簡(jiǎn)單的淋洗除去表面雜質(zhì)達(dá)到固定的目的。本發(fā)明保持了酶法生產(chǎn)收率高，品質(zhì)好以及質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)解決了酶法生產(chǎn)過(guò)程酶無(wú)法回收利用，導(dǎo)致的使用成本高、不能連續(xù)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)，同時(shí)還可以一步合成L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽，且收率高、能耗低、工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12P13/10GK103014086SQ20121053245
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
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