專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種蠟蚧菌 Hecanicillium)發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
臘階菌Cl I Hum)隸屬絲孢菌類(lèi)(Hyphomyce tes),廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶，能寄生蚧類(lèi)、蚜蟲(chóng)類(lèi)、螨類(lèi)和粉虱，還可寄生鱗翅目的一些害蟲(chóng)及線蟲(chóng)、薊馬等。 20世紀(jì)70年代以來(lái)，歐洲一些國(guó)家及美國(guó)、日本等國(guó)對(duì)利用蠟蚧菌防治溫室蔬菜害蟲(chóng)給予極大重視。目前蠟蚧菌、座殼孢菌、擬青霉菌、綠僵菌和白僵菌等都是研究較多的昆蟲(chóng)病原真菌，其中以綠僵菌和白僵菌幾丁質(zhì)酶在國(guó)內(nèi)外研究應(yīng)用最為廣泛(肖燕等，2001 )，而對(duì)蠟蚧菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究在國(guó)內(nèi)外并不多見(jiàn)。用蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶可為將來(lái)真菌防治害蟲(chóng)的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及方法。
本發(fā)明首先提供了一種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料配方為5-15 g/L果糖或麥芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8X10_4mol/L K+或 Ca2+，O. 05-0. 2 g/LVc 或者 VB6，其余為水，培養(yǎng)基初始 ρΗ=5· 5-7. O。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料配方為10g/L麥芽糖，10g/L酵母浸膏，4X10_4mol/L Ca2+，O. lg/LVB6，，其余為水，培養(yǎng)基初始pH=5. 5。
本發(fā)明還提供了一種蠟蚧菌發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，所述方法包含以下步驟 (a)將蠟蚧菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50-100 mL，接種量5-15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
所述種子培養(yǎng)基的原料配方為200g/L土豆,葡萄糖20g /L,其余為水，自然pH。
本發(fā)明采用的蠟蚧菌為蠟蚧菌Z.1ecanii FJ28 (邱君志等，金屬離子對(duì)蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶活力的影響，激光生物學(xué)報(bào)，2009年2月)。
采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡I ld，發(fā)酵周期4d，發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果蠟蚧菌FJ28產(chǎn)幾丁質(zhì)酶為25 U/mL以上。
本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1 NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。
圖3不同維生素對(duì)產(chǎn)酶的影響。
圖4不同氮源對(duì)產(chǎn)酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1
單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分 實(shí)施步驟
(I)種子培養(yǎng)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制20% 土豆汁(土豆切片熬汁)1L，葡萄糖20g，自然pH。分裝于250mL的三角瓶，每個(gè)三角瓶含150mL。1. OlMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對(duì)培養(yǎng)基預(yù)處理。基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基)粉狀幾丁質(zhì)2%、KH2PO4 O. 1%、MgSCV7H20 O. 05%、NaCl O. 02%、pH6. 5。(2)發(fā)酵種子的制作將蠟蚧菌FJ28接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于26°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)4d，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測(cè)定波長(zhǎng)550nm處的吸光值。換算成酶活單位U/mL。(4)幾丁質(zhì)酶酶活測(cè)定取ImL發(fā)酵上清液加入ImL磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· O)和50mL5%膠體幾丁質(zhì)中(以不加膠體幾丁質(zhì)的上清液作為對(duì)照),37°C水浴lh，加入2mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴IOmin后冷卻，離心后取上清液在波長(zhǎng)550nm下測(cè)紫外吸光度，計(jì)算出產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的含量。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)'N為反應(yīng)試劑的總體積；η為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間；m為酶液質(zhì)量或體積，g或mL)。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定在O 100 μ g/mL范圍內(nèi)，以550nm處的吸光值為橫坐標(biāo)(X)、N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的濃度為縱坐標(biāo)(Y)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟如下
a.用超純水配置濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100 μ g/mL 的 NAG。b.取上述濃度的NAG溶液各ImL分別與2mL DNS顯色劑混合并沸水浴IOmin。c.反應(yīng)完畢后，測(cè)定反應(yīng)液在550nm處的吸光值，在上述反應(yīng)體系中以超純水取代NAG為空白對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其平均值用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣的吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到相應(yīng)NAG的量，便可計(jì)算出樣品中幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果見(jiàn)圖1。(6)不同碳源、氮源、維生素對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響
(a)碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，72h發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖2。(b)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加O. 01% VB1, VB2、VB6、Vc, Ve，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，72h檢測(cè)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖3。(c)氮源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%的牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、KNO3> NH4Cl, (NH4)2SO4,〇&_3)2，接入相同的蠟蚧菌液，在261、16017^11的搖床中培養(yǎng)，72h檢測(cè)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖4。
實(shí)施結(jié)果添加不同碳源(葡萄糖、鹿糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉)均提高了酶活性。其中添加麥芽糖使殺蟲(chóng)蠟蚧菌FJ28產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到17. 92U/mL(圖2);其次是添加果糖的處理， 產(chǎn)酶達(dá)到13. 17U/mL的高峰；添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖的處理相對(duì)前兩者其產(chǎn)酶活性要低得多，僅2. 8-5 U/mL。因此，不同碳源對(duì)蠟蚧菌FJ28產(chǎn)酶量影響不同。由此可見(jiàn)，麥芽糖是促進(jìn)蠟蚧菌FJ28產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳碳源。
在添加的不同維生素處理中，與CK相比，Vb6最有助于蠟蚧菌FJ28提高產(chǎn)酶水平 (圖3)，Vc次之。添加其他維生素不利于提升蠟蚧菌FJ28所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性。
在所添加的不同氮源中，添加酵母浸膏的處理最有助于提高產(chǎn)酶水平，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活性達(dá)到5. 34U/mL(圖4)，而添加酵母浸粉、蛋白胨和KNO3的處理也提高產(chǎn)酶量，但較酵母浸膏處理的酶活低。此外，從提升幾丁質(zhì)酶活性總體上看有機(jī)氮優(yōu)于無(wú)機(jī)氮。據(jù)此，酵母浸膏是提高蠟蚧菌FJ28產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳氮源。
實(shí)施例2正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件 (O正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基從單因素實(shí)驗(yàn)確定的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變各成分，和PH值，配置不同的培養(yǎng)基，方法同實(shí)施例1中步驟(1)、(2)。見(jiàn)表1，將相同量的接種量(10%)菌種接種于250mL，裝有50mL 培養(yǎng)液，在26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)4d。然后按實(shí)施例1步驟(3)、(4)測(cè)定酶活。 選取正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果和其產(chǎn)酶量最高的實(shí)驗(yàn)組號(hào)，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為了避免累贅實(shí)施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測(cè)定方法均與實(shí)施例1的方法相同。
表I蠟蚧菌FJ28幾丁質(zhì)酶五因子四水平(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料配方為 5-15 g/L果糖或麥芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8X10_4mol/L K+或Ca2+， O. 05-0. 2 g/LVc或者VB6，其余為水，培養(yǎng)基初始pH=5. 5-7. O。
2.—種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料配方為 10g/L麥芽糖，10g/L酵母浸膏，4X10_4mol/L Ca2+，O. lg/LVB6，，其余為水，培養(yǎng)基初始 pH=5. 5。
3.—種蠟蚧菌發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟(a)將蠟蚧菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50-100 mL，接種量5-15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
4.如權(quán)利3所述蠟蚧菌發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料配方為200g/L 土豆,葡萄糖20g /L,其余為水，自然pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料配方為5-15g/L果糖或麥芽糖，5-15g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8×10-4mol/LK+或Ca2+，0.05-0.2g/LVc或者VB6，其余為水，培養(yǎng)基初始pH=5.5-7.0。該方法通過(guò)將發(fā)酵種子液按接種于培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102994483SQ20121054389
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 蘇禮超, 蔡志雄, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 李小霞, 何肖云, 毛麗慧, 謝小聰 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)