專利名稱：一種扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基及方法
技術領域：
本發明涉及真菌的發酵培養基及其工藝。確切的講，本發明涉及一種扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基及方法。
背景技術：
殼聚糖酶(Chitosanse EC3. 2. I. 132)又稱殼聚糖-N乙酰-氨基葡糖苷水解酶，是一種分解殼聚糖的專一性酶，廣泛分布在細菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，其大部分為堿性蛋白，等電點PI為7. 0-8. 5，最適pH為4. 5-8. O。在pH為6. 0-8. 0，37°C時殼聚糖酶非常穩定，超過40°C后酶很快失活。殼聚糖酶能夠水解含有殼聚糖的細胞壁，在室溫下可穩定存在幾個小時，冷凍和干燥情況下則可數月保存，酶粉可溶于水和一系列緩沖溶劑，活性PH和溫度范圍很廣。70年代初期，Monaghant在研究細菌和真菌過程中，首先提出殼聚 糖酶是一種不同于幾丁質酶的新酶，這種酶對膠態幾丁質不水解，但是能夠降解完全脫乙酰化的殼聚糖，被認為是對線性殼聚糖具有水解專一性的一種酶，1992年殼聚糖酶被系統命名。2004年，國際酶委員會對殼聚糖酶的定義作了修改，重新定義為以內切方式催化水解部分乙酰化殼聚糖中的β_1，4氨基葡萄糖苷鍵的酶。殼聚糖酶主要存在于真菌和細菌細胞中，在單子葉和雙子葉植物的不同組織中也發現有該酶活性。在殼聚糖等在殼聚糖酶的作用下產生的殼寡糖具有重要的價值，能提高機體的免疫能力和抗癌能力，改善腸道微生物的區系分布等醫學作用。農業上其可以刺激有益苗的生長，還可作為植物功能調節劑，刺激植物生長口，增強農作物對病蟲害的防御能力。在食品上對乳酸的后酸化起到了極為明顯的抑制作用等。

發明內容
本發明的目的在于提供一種扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基及方法。首先本發明提供了一種扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基，所述培養基的原料由A液和B液組成，A液為膠體殼聚糖，質量濃度為O. 3 1%，ρΗ=5 6. 2，B液按重量分數由以下組成=NaH2PO4 O. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 O. 1-0. 3%, NaNO3 O. 1-0. 3%, MgSO4'7Η20 O. 05-0. 2%, CaCL2 O. 002-0. 003%，KCl O. 3-0. 5%，L-阿拉伯糖 3_4%，葉酸 O. 04-0. 05%，余量為水；將A液與B液分開高壓滅菌，待各自冷卻到60°C時等體積混合。優選地，所述膠體殼聚糖，質量濃度為O. 375%，pH=5。優選地，所述B液按重量分數由以下組成NaH2PO4 O. 41%, (NH4)2SO4 3%, Na2HPO4O. 2%, NaNO3 O. 2%, MgSO4。7H20 O. 1%，CaCL2 O. 002%, KCl O. 4%, L-阿拉伯糖 3%,葉酸 O. 04%,
余量為水。本發明還提供了一種扁座殼孢菌發酵產殼聚糖酶的方法，所述方法包含以下步驟
(I)菌種種子培養菌種活化后接種于種子培養基，在26土TC, 160rpm的條件下培養2 3d，制得發酵種子液；(2)將步驟(I)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1、2或3所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量2mL/50 mL，在轉速160rpm，26± 1°C下培養。所述種子培養基的原料含有20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH5. O。所述的扁座殼孢菌(何學友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。膠體殼聚糖的制備方法如下殼聚糖3g溶解于O. 2mol/L的HCl 200mL中，溶液放在韋林氏攪拌器中攪拌，開始用lmol/L NaOH，最后用O. I mol/L NaOH，溶液被中和至堿性(pH9. O)。得到的沉淀在1000r/min下離 心20min，，并用水重復洗滌，直到上清液的PH呈中性。洗滌后的沉淀懸浮于蒸餾水中，且懸浮液的pH用醋酸鈉調整至5 6. 2，最后的濃度為0. 3 1% ( w/ V ) ο本培養基與現有培養基相比有以下突出特點
(I)產酶高效
對于現有的培養基一般產酶周期要72小時，但本培養基只需48小時酶活就能夠達到最聞。其廣酶效率大大提聞了。(2)酶活大幅度提高
現有的培養基(L-阿拉伯糖 0. 375w%, (NH4)2SO4 3 w %，KCl 0. 4 w%,葉酸 O. 04 w%)酶活是20. 37 U/ mL。min.(用DNS法測定)，而優化的培養基酶活是其2. 153倍，達到43. 86U/ mL°min
(3)培養基的配方更切合實際
現有培養基中的A液要求通過乙酸鈉調pH達到6. 2，由于A液殼聚糖膠體是利用1%的醋酸鈉配制而成，其酸性較強，需要較多的乙酸鈉去調試pH，而優化后的培養基pH只需要求達到5. O,促使調pH的乙酸鈉的量大大降低。


圖I為氨基葡萄糖的標準曲線。
具體實施例方式本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。實施例I
單因素實驗確定培養基最優成分
(I)菌種種子培養將菌從斜面到250ml錐形瓶的擴大培養，接種量為Icm2菌落，在26°C左右，160rpm條件下的種子培養基中培育48小時。斜面培養基為PDA培養基。種子培養基20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH5. O。(2)將(I)所得的種子液接種到優化前培養基(發酵)
A液1%膠體殼聚糖(pH6. 2)(制備方法參考王艷等，假單胞菌產殼聚糖酶突變菌株的篩選.中國海洋藥物雜志，2004，23 (5): 38-40)。B 液=KH2PO4 0. 44%, Na2HPO4 0. 2%, (NH4)2SO4 0. 16%, NaNO3 0. 2%, MgSO4' 7H200. 1%，CaCL2 0. 002，KCL 0. 3%，蛋白胨 0. 1%，酵母膏 0. 1% (pH 正常)待A液、B液冷卻至60攝氏度時等體積混合，在條件裝液量30mL，轉速135rpm，接種量ImL/ 50mL，溫度26°C下培養，分別測24、48、72、96小時的酶活。發現72小時酶活達到最聞。(3)殼聚糖酶活力的測定
取稀釋后的粗酶液ImL與2mL pH5. O的2. 5%的膠體殼聚糖混合，60°C水浴30min，沸水浴IOmin滅活流水冷卻。用2mol/L NaOH調節反應液的pH超過8. 0，在15000rpm下離心IOmin,除去未反應的底物。取O. 5mL的上述酶液與膠體殼聚糖反映后離心的上清液，加O. 5mL DNS試劑，混合均勻后，沸水浴加熱5min后，迅速加入冷水中冷卻，加蒸餾水至IOmL混勻，以蒸餾水作對 照，于540nm波長處讀取吸光度值，查標準曲線轉化為還原糖的微克數。同樣以滅活的酶液加DNS試劑反應為對照來扣除發酵液中的殘糖。在上述反應條件下，每小時釋放出Iyg氨基葡萄糖或相當于氨基葡萄糖的還原糖所需要的酶量為I個酶活力單位
(4)氨基葡萄糖標準曲線的制定
氨基葡萄糖標準溶液的配置在105°C下烘干至衡重后，稱取O. 863g氨基葡萄糖鹽酸鹽，蒸懼水定容至500mL,配置成8 μ mol/mL的標準溶液；
表I氨基葡萄糖系列溶液取若干支干凈的試管，按表I將8 μ moL / mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽配成各濃度的氨基葡萄糖溶液，震蕩均勻。表I氨基葡萄糖系列溶度
權利要求
1.一種扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料由A液和B液組成，A液為膠體殼聚糖，質量濃度為0. 3 l%，pH=5 6. 2，B液按重量分數由以下組成=NaH2PO4 0. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 0. 1-0. 3%, NaNO3 0. 1-0. 3%, MgSO4' 7H200. 05-0. 2%, CaCL2 0. 002-0. 003%, KCl 0. 3-0. 5%, L-阿拉伯糖 3-4%,葉酸 0. 04-0. 05%,余量為水；將A液與B液分開高壓滅菌，待各自冷卻到60°C時等體積混合。
2.根據權利要求I所述的扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基，其特征在于，所述膠體殼聚糖，質量濃度為0. 375%，pH=5。
3.根據權利要求I所述的扁座殼孢菌發酵生產殼聚糖酶的培養基，其特征在于，所述B液按重量分數由以下組成NaH2P04 0 . 41%，(NH4)2SO4 3%，Na2HPO4 0. 2%，NaNO3 0. 2%，MgSO4-7H20 0. 1%，CaCL2 0. 002%, KCl 0. 4%, L-阿拉伯糖 3%,葉酸 0. 04%，余量為水。
4.一種扁座殼孢菌發酵產殼聚糖酶的方法，其特征在于所述方法包含以下步驟 菌種種子培養菌種活化后接種于種子培養基，在26±1°C, 160rpm的條件下培養2 3d，制得發酵種子液； 將步驟(I)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1、2或3所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量2mL/50 mL，在轉速160rpm，26± 1°C下培養。
5.如權利4所述扁座殼孢菌發酵產殼聚糖酶的方法,其特征在于,所述種子培養基的原料含有20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH5. O。
全文摘要
本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種扁座殼孢發酵生產殼聚糖酶的培養基及方法。所述培養基的原料含0.3～1w%膠體殼聚糖，pH=5～6.2，NaH2PO4 0.3-0.5%，(NH4)2SO4 2-4%，Na2HPO4 0.1-0.3%，NaNO3 0.1-0.3%，MgSO4·7H2O 0.05-0.2%，CaCl2 0.002-0.003%，KCl 0.3-0.5%，L-阿拉伯糖3-4%，葉酸0.04-0.05%。該方法通過將發酵種子液按接種于培養基，接種量2mL，于26℃，轉速160r/min下培養。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；培養基具有蛋白酶產率高，蛋白酶活力高等優點。
文檔編號C12R1/645GK102978190SQ201210543898
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者邱君志, 吳國輝, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 蘇禮超, 李小霞, 何肖云, 郭慶豐, 毛麗慧 申請人:福建農林大學