專利名稱：一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基及方法
技術領域：
本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基及方法。
背景技術：
漆酶(Laccase)是一種含銅多酚氧化酶，它能催化一系列有機和無機化合物發生一個電子氧化，同時伴隨有氧還原成水。目前已發現多種生物能產生漆酶，包括植物、真菌、 昆蟲、細菌等。其中，以真菌中的白腐菌分布最多(鈔亞鵬等，2001)。
漆酶具有廣泛的底物作用范圍，可催化多種酚類和芳香胺類化合物的氧化，降解多環芳烴。因此,在生物降解、制漿造紙中、廢水處理、生物漂白、污染物脫毒、土壤修復等方面，漆酶具有重要的應用價值。目前，漆酶的研究己在多領域、多水平上展開。許多由真菌引起的植物病害中，漆酶被顯示是一個重要的毒力因子[8]。揭示蟲生真菌是否能產漆酶，可為蟲生真菌生防作用的深入研究提供依據。對蟲生真菌漆酶的研究結果若能應用在對害蟲的生物防治，無疑能更大限度地開發利用生物資源。
扁座殼孢是一種重要的昆蟲病原真菌,在農林害蟲生物防治中具有廣泛的應用前景。該菌屬子囊菌門(Ascomycota)糞菌綱i^orchriomycetes) 肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科ijOlsvicipitsceeie)座殼孢屬(Aschersonia),而對扁座殼孢發酵生產漆酶國內鮮有報道，具有較大的發展前景。發明內容
本發明的目的在于提供一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基及方法。
本發明首先提供了一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基，所述培養基的原料含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10義1 X l(T3wt%， 培養基初始pH=3. 8-4. 4。
更優選地，所述培養基的原料按重量分數計，含有葡萄糖O. 5wt%, (NH4) 2S044wt%, Zn2+O. 5X 1(T4 mol/L, VB4 5Χ 1(Γ4 wt%,培養基初始 pH=4. 4。
其次，本發明還提供了一種扁座殼孢發酵生產漆酶的方法，所述方法包含以下步驟(a)將扁座殼孢接種種子培養基，制得發酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為 50mL，接種量lmL，于25°C，轉速160 r/min下培養。
所述種子培養基的原料含有按培養基重量計，20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏 1%，自然pH。
本發明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。
采用本發明優化后的培養基，菌齡4d，發酵周期3d，玻璃珠O個，發酵產生結果扁座殼孢產漆酶為45U/mL以上。本發明的有益效果本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基，具有漆酶產率高，漆酶活力高等優點。


圖1不同碳源對產酶活性的影響。注圖中Dex、D-Sor、Ma1、Fru、Sue、Myc、SS、Car、L-Ara, CK分別表示葡萄糖、D-山梨醇、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、L-阿拉伯糖和對照組。圖2不同氮源對產酶活性的影響。注圖中YE、YEP、Try、PN、Cas, AS、SN、P印、Ure, CK分別表示酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨、尿素和 對照組。圖3不同維生素對產酶活性的影響。圖4不同無機鹽離子對產酶活性的影響。圖5不同初始pH對產酶活性的影響。
具體實施例方式本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。實施例1
單因素實驗確定培養基最優成分
(I)種子培養基和基礎培養基配制
(a)種子培養基20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。1. OlMPa，滅菌20min。(b)基礎培養基20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。l.OlMPa，滅菌20mino(2)發酵種子的制作將扁座殼孢接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于25°C下培養5d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養基，25°C，轉速160r/min下培養24h，即為發酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長465nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo(4)漆酶酶活測定取O. 2mL發酵上清液加入3. 3mL醋酸緩沖液(pH4. 4)和O. 5mL4. OmmoI/L愈創木酚中(以熱滅活上清液作為對照)，25°C水浴5min，冰浴加入2mL 16. 5%三氯乙酸試劑終止反應，離心后取上清液在波長465nm下測吸光度。
IO6、V總....ΔΑ
酶活力(U/g或UML)= -
F 酶ε-- Δ
式中，X為樣品的吸光度分別代表反應體系總體積及反應酶液的體積；ε為吸光系數(ε 465 =1. 21 X 10_4mol/L · cm)；以每分鐘氧化底物1. O μ mo I來定義酶活。
(5)不同碳源、氮源、維生素、無機鹽離子、初始pH對產漆酶的影響。
(a)碳源對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加2%葡萄糖、D-山梨醇、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉和L-阿拉伯糖，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養，設置對照組，每天檢測發酵液中漆酶活性。
(b)氮源對產酶的影響，在基礎培養基中分別添加1%的酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨和尿素，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/ min的搖床中培養，設置對照組，每天檢測發酵液中漆酶活性。
(c)維生素對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加O. 01% VB1, VB2、Vb4、Vb6, Vc, VE、，接入等量的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養，設置對照組，每天檢測發酵液中漆酶活性。
(d)無機鹽離子對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加相同摩爾數的無機鹽離子(O. 4mmol NaH2PO4 · 2H20、KH2PO4、CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20、MgSO4 · 7H20、 FeSO4 WH2CKCoCI2 ·6Η20、Μη504)，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養，設置對照組，每天檢測發酵液中漆酶活性。
(e)初始pH對酶產量的影響，用基礎培養基分別提供不同酸堿度的培養環境(pH 值 3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5)，接入等量的扁座殼孢菌液，在 25°C、160r/ min的搖床中培養，設置對照組，每天檢測發酵液中漆酶活性。
實驗結果碳源對酶產量的影響如圖1所示，添加葡萄糖大幅提高了漆酶活性。在接種后第3d 就出現漆酶活性高峰，酶活性達到43. 27U/mL。添加D-山梨醇、果糖、可溶性淀粉的處理，在接種后第3d酶活分別達到14. 40U/mL、14. 43U/mL、16. 60U/mL,與對照組酶活15. 43U/mL相近；添加海藻糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉、蔗糖和L-阿拉伯糖的處理都對供試菌產酶有不同程度的抑制作用。添加蔗糖和L-阿拉伯糖的處理檢測不到酶活。
氮源對產酶的影響如圖2所示，在所添加的不同氮源中，添加酵母膏、酵母浸粉和硫酸銨的處理有助于提高產酶水平，酶活性分別達到40. 55U/mL、39. 19U/mL、41. 62U/mL, 而添加干酪素、蛋白胨的處理較對照處理的酶活低，二者對供試菌產酶具有抑制作用。此夕卜，胰蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素的處理對其有強烈的抑制作用。據此，硫酸銨是扁座殼孢菌產漆酶的最佳氮源。
維生素對酶產量的影響如圖3所示，在所添加的不同維生素里，與CK相比，維生素B4最有助于扁座殼孢菌提高產酶水平(圖5)，維生素C次之，然后是復合維生素，所測得酶活力分別為45. 22U/mL、37. 58U/mL、29. 06U/mL。實驗結果表明添加維生素B1、維生素 B6均 能增加扁座殼孢菌產漆酶。而維生素B2與維生素E對產酶則有顯著的抑制作用，測得酶活僅為6. 54U/mL、6. 06U/mL。
初始pH對酶產量的影響如圖4所示，在所添加的相同摩爾數不同種無機鹽離子中，添加Na+、Zn2+、Fe2+、C02+的處理均有助于提高該菌產漆酶能力，酶活性分別達到19. 87U/ mL、36. 18U/mL、35. 23U/mL、23. 66U/mL，而添加 K+、Fe3+、Mg2+、Mn2+ 的處理較對照處理的酶活低，對供試菌產酶具有抑制作用。此外，Cu2+對扁座殼孢菌產漆酶無明顯的促進作用。據此，Zn2+最能提高扁座殼孢菌產漆酶。無機鹽離子對酶產量的影響如圖5所示，在不同初始pH的培養基中培養后，pH=4. O的處理有助于提高產漆酶能力，酶活性達到30. 93U/mL,初始pH=4. 5的處理，其酶活值也達23. 80 U/mL。據此，初始pH=4. 0-4. 5最能提高扁座殼孢菌產漆酶。實施例2
正交實驗確定最優發酵條件 (O正交實驗確定最佳培養基
從單因素實驗確定的培養基的基礎上，改變各成分的溶度，和PH值，配置不同的培養基，方法同實施例1中步驟(I)、(2)。見表1，將相同量的接種量(10%)菌種接種于250mL， 裝有50mL培養液，在25°C，轉速160 r/min下培養培養3d。然后按實施例1步驟(3)、(4)測定酶活。選取正交實驗最優結果和其產酶量最高的實驗組號，進行驗證實驗。為了避免累贅實施例中的培養基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實施例1的方法相同。表I扁座殼孢漆酶五因子四水平(45)正交實驗設計
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表2扁座殼孢漆酶五因子四水平(45)正交實驗設計實驗結果
權利要求
1.一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料中含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10義1 X l(T3wt%，培養基初始 pH=3. 8-4. 4。
2.根據權利要求1所述的扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料按重量分數計，含有葡萄糖 O. 5%，(NH4) 2S04 4%，Zn2+O. 5 X 10_4 mol/L, VB4 5 X 10_4%，培養基初始pH=4. 4。
3.一種扁座殼孢發酵生產漆酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟Ca)將扁座殼孢接種種子培養基，制得發酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1或2所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量lmL，玻璃珠O個，于25°C，轉速160 r/min下培養。
4.根據權利要求3所述的扁座殼孢發酵生產漆酶的方法，其特征在于，所述種子培養基的原料含有按培養基的重量計算，含有20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。
全文摘要
本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基及方法。所述培養基的原料含有葡萄糖1-4wt%，(NH4)2SO41-4wt%，Zn2+0.5×10-4-4×10-4mol/L，VB41×10-4-1×10-3wt%，培養基初始pH=3.8-4.4。該方法通過將發酵種子液按接種于培養基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量1mL，玻璃珠0個，于25℃，轉速160r/min下培養。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發酵生產漆酶的培養基，具有漆酶產率高，漆酶活力高等優點。
文檔編號C12N9/02GK102994464SQ20121054368
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者邱君志, 蘇禮超, 吳寶杰, 李小霞, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧 申請人:福建農林大學