專利名稱：一種lhx3基因輔助檢測黃牛生長性狀的方法及其專用試劑盒操作規則的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及基因單核苷酸多態性的檢測，特別涉及一種LHX3基因輔助檢測黃牛生長性狀的方法及其專用試劑盒操作規則。
背景技術：
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander (1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/G/C/T)的變化而引起的多態性。它的變異形式有:顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，基因編碼區內的SNPs (cSNPs)比較少，因為在外顯子內的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。標記輔助選擇就是將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經歷了三個階段:第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現分子標記輔助選擇的目標。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。分子育種，即分子標記輔助選擇(molecular mark-assist selection, MAS),該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。在畜禽育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關，并且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP) ,PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。

LHX3基因隸屬LIM同源框基因家族，所編碼的蛋白家族負責LIM結構域形成，該結構域富含獨特的半胱氨酸和鋅指結合域。LIM同源框基因的蛋白質翻譯產物不僅具有與DNA相互結合的保守的同源框結構域(homeo-domain, HD),而且含有2個富含半胱氨酸和組氨酸的蛋白與蛋白互作的LM結構域(LIM domain)，這些UM同源框轉錄因子(LIMhomeodomain transcription factor)作為一類家族性轉錄因子調控體內一些基因的表達，決定發育中組織和細胞的特異性分化。LHX3基因的多態性來自于其基因序列中的單堿基變異，迄今為止，已經發現多種LHX3基因的多態性。在人上，已報道的LHX3基因的突變包括:外顯子2存在23bp的缺失；Y111C, A210V, E173Ter，and W224Ter。轉錄因子突變多表現為復合性垂體激素缺乏，如GH、催乳素、促甲狀腺激素、促性腺激素。轉錄因子LHX3的突變可影響垂體的發育，從而引起GH等垂體激素的缺乏。研究揭示，在人上LHX3基因的點突導致該基因對于垂體基因激活調控功能受損，從而引起垂體激素分泌紊亂。該基因突變導致組合型垂體激素缺乏癥的發生，頸椎棘突硬化。該基因的突變與生長激素、催乳素、黃體生成素、卵泡刺激素、促甲狀腺素的缺乏以及完整的促皮質激素功能有關。而且LHX3基因具有相當程度的多態性，這些多態位點在不同的品種以及同一品種的個體間也有差異。以此為基礎，深入研究LHX3的多態性及其表達特征與生產性能的關系，在家畜的品種改良、選育以及實施準確度較高的標記輔助選擇(MSA)方面都有重要的應用前景和使用價值。

本實驗室的研究結果表明LHX3突變純合基因型TT對秦川牛群體的生長性狀有顯著不利影響(P〈0.05)。以上研究表明，LHX3基因可以作為秦川牛生長性狀有效選擇標記。

發明內容
本發明解決的技術問題在于提供一種檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法，尋找與經濟性狀關聯的SNP作為分子標記，加快具有優質經濟性狀黃牛種群的建立。本發明通過以下技術方案來實現:一種檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，以包含LHX3基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛LHX3基因；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小；用變性劑處理PCR擴增產物之后，再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定黃牛LHX3基因第10385位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為:上游引物:5’ -TTCCACCGCAGACGAGCCAGC-3 ’ ；下游引物:5’-GCATCGGGGTACACCAAGC-3’ ；所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性 4min ;94°C變性 30s，66.5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環；72°C延伸IOrnin0瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為
1.5%。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳質量濃度為10%。所述根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛LHX3基因第10385位的單核苷酸多態性為:GG基因型表現為10385位為核苷酸G純合；GT基因型表現為10385位為核苷酸G/T雜合；TT基因型表現為10385位為脫氧核苷酸T純合；其中，單核苷酸多態性TT基因型為突變純合基因型。與現有技術相比，本發明具有以下獨特的技術效果:本發明根據已公布牛LHX3基因(GenBank Accession N0.AY923832)的序列設計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序，將測序后得到的黃牛LHX3基因的部分序列與NCBI公布的序列進行比較，發現在LHX3基因的第10385位存在SNP多態性。針對上述第10385位的SNP多態性，本發明還公開了其篩查和檢測方法，進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，用變性劑處理擴增產物后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸的多態性。本發明提供的檢測方法為LHX3基因的SNP與黃牛部分生長性狀進行關聯分析，研究表明基因型對秦川牛群體的體重等性狀有顯著影響(p〈0.05)。以上研究表明，LHX3基因結果表明該位點能夠作為提高黃牛體重等生長性狀的分子標記，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。本發明還涉及一種用于實施本發明所述方法的專用試劑盒，所述試劑盒內容包括:一、試劑盒引物成分:1.1特異引物，所述的特異弓I物包括:F:5’TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3’R:5'GCATCGGGGTACACCAAGC 3’1.2生化試劑，所述生化試劑包括:`
TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內含Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ；二、試劑盒操作說明:2.1PCR操作說明(I) PCR擴增反應體系PCR反應體系見表2。(2) PCR擴增反應程序95°C預變性 4min ;94°C變性 30s，66.5°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環；72°C延伸IOrnin02.2電泳檢測與基因型判斷( I) PCR產物的瓊脂糖電泳檢測擴增得到長度為261bp的PCR產物，經用1%的瓊脂糖電泳檢測，表現唯一的261bp的PCR條帶，見圖2所示。(2 ) PCR 產物的 SSCP 分析對每個個體擴增片段變性處理后，進行10%聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測，其個體可以出現GG，或GT，或TT帶型，見圖4所示。2.3待檢個體的選擇與淘汰依據表4的分析結果(秦川牛LHX3基因座基因型GG個體的體重顯著大于基因型GT和TT個體)，將GT，TT型個體淘汰；GG型個體留種進行擴繁，將形成一個優良的群體。2.4注意事項(I)DNA的提取可以按照以上提供的步驟操作，也可以依據不同廠家的全血DNA提取試劑盒的要求來提取，但是要保證DNA的純度，若提取效果不佳，需要純化后再進行后續的試驗。(2)反應體系和反應程序可以依據不同的廠家產品的要求來操作，但要保證擴增的特異性和擴增產物的濃度，以免影響后續的試驗結果。


圖1是本發明的技術流程示意圖。圖2是本發明用來檢測PCR產物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳(泳道1-4分別代表不同黃牛個體的PCR擴增產物；M SMarker I，條帶分別為IOObp, 200bp, 300bp, 400bp,500bp,600bp)。圖3是本發明中PCR產物混合測序篩查到的黃牛LHX3基因序列10385位G-T突變測序結果圖(黑色方框所指處為單核苷酸突變位置，自上至下分別為GG、GT和TT基因型的測序結果圖)。圖4是本發明用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳(自左至右泳道分別代表基因型GG、GT和TT的電泳帶型)。
具體實施例方式
本發明首先根據NCBI 公布的 LHX3 基因序列(GenBank Accession N0.AY923832)設計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和生長性狀的關聯分析，篩選出與黃牛生長性狀密切相關的分子標記。下面對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I地方黃牛品種LHX3基因部分DNA序列的克隆1、黃牛樣本采集本發明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1:河南南陽牛(263)，陜西秦川牛(302)，河南郟縣紅牛(143)；表I黃牛樣本的采集
權利要求
1.一種檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于， (1)以包含LHX3基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛LHX3基因， 所述的引物對P為: 上游引物 Pl:5' TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3'； 下游引物 P2:5' GCATCGGGGTACACCAAGC 3'; (2)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(I)中PCR擴增產物片段大小； (3)用變性劑處理步驟(I)中PCR擴增產物之后，再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定黃牛LHX3基因第10385位的單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟(I)所述的PCR擴增反應程序為: 95°C預變性4min ;94°C變性30s，66.5°C退火30s，72。。延伸30s，34個循環；72°C延伸IOmin0
3.如權利要求1所述的檢測黃牛LHX3基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求1所述的檢測黃牛LHX3基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質量濃度10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.如權利要求1所述的檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，所述步驟(3)中根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定黃牛LHX3基因第10385位的單核苷酸多態性為:GG基因型表現為10385位為核苷酸G純合；GT基因型表現為10385位為核苷酸T/C雜合；TT基因型表現為10385位為核苷酸T純合；其中，單核苷酸多態性TT基因型為突變純合基因型。
6.權利要求1-5中任意一權利要求所述的檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性的方法在鑒定不同黃牛群體多態性中的診斷應用。
7.權利要求6所述的應用，其特征在于用于中國黃牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇中的應用。
8.一種用于檢測黃牛LHX3基因單核苷酸多態性方法的專用試劑盒，所述試劑盒的內容包括: (1)特異引物，所述的特異引物包括: 上游引物 P1: 5' TTCCACCGCAGACGAGCCAGC 3'； 下游引物 P2:5' GCATCGGGGTACACCAAGC 3'; (2)生化試劑，所述生化試劑包括: TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內含 Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNA Marker I ； (3)操作說明書所述操作說明書包括 PCR操作說明； 電泳檢測與基因型判斷；待檢個體的選擇與淘汰； 注意事項。
全文摘要
本發明公開了一種檢測黃牛生長性狀的基因診斷試劑盒，是一種LHX3基因檢測黃牛生長性狀的方法，該方法以包含LHX3基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛LHX3基因；通過DNA測序和PCR-SSCP技術進行基因多態性的檢測與快速分型。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與秦川牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記，故本發明提供的檢測方法可用于秦川牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇，進而快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。本發明檢測方法簡單、成本低，檢測結果直接、可靠，適用于對LHX3基因第10385位突變的大規模的篩查和診斷。
文檔編號C12Q1/68GK103146809SQ201210549050
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者陳宏 , 黃永震, 靖永杰, 藍賢勇, 雷初朝, 胡沈榮 申請人:西北農林科技大學