專利名稱：一種擬穴青蟹線粒體全基因組dna及檢測方法
技術領域：
本發明屬于擬穴青蟹基因組學領域，特別是涉及一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測方法。
背景技術：
在絕大多數的多細胞動物中，線粒體基因組DNA為典型的閉合環狀結構，長度在14 18kb之間，能夠自主復制和轉錄。線粒體·基因組通常編碼37個基因，包括13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因，此外，還包含I個大的非編碼區(controI region)。線粒體全基因組不僅能夠提供比單基因更多的遺傳信息，而且能夠揭示出基因組水平的特征，從而有助于更好的理解基因組進化與發育特點。到目前為止，學者們已經揭示了較多甲殼類動物的線粒體全基因組DNA信息，包括斑節對蝦、中國對蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹、日本轉等。由于具有單倍性、低重組率、母性遺傳及進化速率快等特點，線粒體DNA已經被廣泛地應用于遺傳學、系統進化學及物種鑒定等領域。擬穴青蟹(Scyl Iaparamamosain)俗稱青蟹,在我國主要分布于長江口及以南沿海海域，是我國重要的海洋漁業資源和海水養殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長速度快、肉味鮮美等優點，深受廣大消費者青睞。近年來，我國擬穴青蟹的人工養殖年產量一直穩定在10萬噸以上，保持了健康的發展勢頭。學者們圍繞擬穴青蟹繁殖生物學、養殖生物學等方面已經開展了較多的研究工作。此外，開展了微衛星和SNPs分子標記研究，同時，還克隆了擬穴青蟹線粒體CO1、12S rRNA和16S rRNA基因序列，并分別利用這3種基因標記分析了青蟹屬4個種的系統進化關系。然而，單基因標記所揭示的遺傳信息遠低于全基因組所提供的信息，并且有可能對研究結果起誤導作用。因此，有必要開展擬穴青蟹線粒體全基因組DNA研究，從基因組水平揭示其系統進化關系和種群遺傳多樣性水平。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測方法，該方法具有快速、低成本、容易掌握等優點，所獲得的線粒體全基因組DNA可應用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質資源鑒定與保護及系統發育等領域。本發明的獲得的擬穴青蟹線粒體全基因組DNA為閉合環形結構，長度為15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發明的擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，包括( I)擬穴青蟹線粒體相關基因序列的收集與分析可通過三種方法獲得擬穴青蟹的線粒體相關基因序列一是從測序獲得的基因組文庫或轉錄組文庫中查找；二是從GenBank數據庫中公開的擬穴青蟹基因序列中查找；三是若通過以上兩種渠道無法獲得相關基因序列，則可通過收集近緣種的線粒體序列進行同源比對，在保守區設計簡并引物，然后以擬穴青蟹的DNA為模板進行PCR擴增，通過測序后獲得擬穴青蟹線粒體部分基因序列。最后，將獲得的部分基因序列與近緣種的線粒體全基因組序列進行比對，分析相關基因在近緣種的線粒體全基因組序列上的相對位置。(2 )引物設計與PCR擴增根據擬穴青蟹線粒體基因在近緣種全基因組序列上的相對位置，以擬穴青蟹基因為模板設計引物，采用PCR方法擴增相鄰的兩個已知基因間的未知序列。PCR擴增反應體系為25 yl，包括基因組DNA模板I yl、終濃度均為0.4iimol/L的上下游引物、終濃度為1. 5mmol/L Mg2+、終濃度為 0. 2mmol/L dNTP、0. 75U TagDNA 聚合酶、I XPCR buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25iU ;反應程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個循環；最后于72°C延伸5分鐘。PCR反應完成后，采用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的質量。所述步驟(2)中的引物序列和退火溫度如表1:表I
權利要求
1.一種擬穴青蟹全基因組DNA，其特征在于所述DNA分子為閉合環形結構，長度為15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，包括 (1)收集擬穴青蟹線粒體相關基因序列，并與近緣種的線粒體全基因組序列進行比對，分析相關基因在近緣種的線粒體全基因組序列上的相對位置； (2)根據線粒體基因在近緣種全基因組序列上的相對位置設計引物，采用PCR方法擴增相鄰的兩個已知序列間的未知序列； (3)對PCR產物進行測序、序列分析，將所有線粒體相關基因序列進行組裝，獲得全基因組DNA序列。
3.根據權利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)中線粒體相關基因序列來源于測序獲得的基因組文庫或轉錄組文庫、GenBank數據庫中公開的擬穴青蟹線粒體基因序列；或通過近緣種的線粒體序列進行同源比對，并在保守區設計簡并引物，然后以擬穴青蟹DNA為模板進行PCR擴增，測序后獲得擬穴青蟹線粒體部分基因序列。
4.根據權利要求3所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)中的近緣種為鋸緣青蟹、欖綠青蟹、紫鰲青蟹、三疣梭子蟹或日本蟲尋。
5.根據權利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中的引物共3對，其引物序列和退火溫度為Sp-ND3-5 F GGAGCTTTAGAATGATCTAAGTAATRAAAGTAGCAGATAAAGGTTGATTTG 退火溫度為53°C ；Sp-16-12S F AATTATCCCTGATACACAAGGTACARTTAGTCTTGTCAGAGGAACCTGTT 退火溫度為55°C ；Sp-12-ND2 F AAAGTATAACCGCAACTGCTGGCACRTTAATTCAAACAGAACTAAAGAGAT 退火溫度為60°C。
6.根據權利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴增反應體系為25 yl，包括基因組DNA模板I yl、終濃度均為.0.4umol/L 的上下游引物、終濃度為1. 5mmol/L Mg2+、終濃度為 0. 2mmol/LdNTP、0. 75U TagDNA聚合酶、I XPCR buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25 ;反應程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個循環；最后于72°C延伸5分鐘。
7.根據權利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中的PCR產物的測序方法為雙向、直接測序。
8.根據權利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中的組裝方法是以鋸緣青蟹的線粒體全基因組DNA序列為參照物，將所有擬穴青蟹線粒體的基因序列進行拼接，獲得擬穴青蟹線粒體全基因組DNA。
全文摘要
本發明涉及一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測方法，該DNA分子為閉合環形結構，長度為15824bp；檢測方法包括(1)擬穴青蟹線粒體相關基因序列的收集及與近緣種線粒體全基因組序列的比對；(2)引物設計與PCR擴增；(3)PCR產物測序與序列組裝。本發明獲得了擬穴青蟹線粒體全基因組DNA序列。本發明的檢測方法具有快速、低成本、容易掌握等優點，所獲得的線粒體全基因組DNA可應用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質資源鑒定與保護及系統發育等領域。
文檔編號C12Q1/68GK103060332SQ20121055363
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者馬洪雨, 馬凌波, 馬春艷 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所