專利名稱：一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法
技術領域：
本發明涉及工業微生物領域,特別涉及一種漢遜酵母(H. polymorphaDL-1)發酵生產谷胱甘肽的方法。
背景技術：
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經肽鍵縮合而成的一種同時具有Y-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物，即Y-L-谷氨酰-L-半光氨酰甘氨酸，分子式為CltlH18O6N3S,相對分子量為307. 33，熔點189°C _193°C (分解)，晶體呈無色透明細長柱狀或板狀，等電點為5. 93。GSH存在于所有生物細胞中，在許多重要的生物學現象中起著直接或間接的作用，如物質運輸、蛋白質合成、新陳代謝及細胞保護等。隨著對GSH研究的不斷深入，GSH在臨床及食品領域中的應用日益廣泛。此外，GSH在面制品、 乳制品、肉類及海鮮制品、保健性功能食品中的應用也越來越廣泛，因此，GSH的市場需求量不斷增加。日本在20世紀50年代就開始了對GSH的研究，目前已實現了 GSH的工業化生產。相對而言，我國對GSH的研究起步較晚，在諸多領域如食品方面的應用還處于起始階段。同時，GSH作為一種抗氧化劑，其市場價格昂貴，而我國GSH的主要來源依靠進口，因此，亟需自主研發一套高產、低成本、低能耗的GSH的生產方法。目前，GSH的生產方法主要有萃取法、化學合成法、發酵法、固定化酶法。綜合比較，利用微生物發酵生產GSH具有明顯的優勢，如微生物存在培養簡單、易于高密度發酵、成本相對較低，目前已成為生產GSH最有效的方法。

發明內容
本發明的目的在于提供一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，該方法具有高產量、低成本的特點。為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案。將多形漢遜酵母斜面種子經種子培養后接種在發酵培養基中進行發酵培養，發酵培養首先在較高的適宜酵母生長的溫度下培養，細胞生長達到穩定期后，降低培養溫度，將溫度調節到GSH的最適生產溫度，繼續培養，收獲細胞后測定胞內及發酵液中GSH含量。( I)菌株以多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha DL-1, H. polymorpha DL-1)為出發菌株，經斜面培養得斜面種子，斜面種子于陜西科技大學藥劑實驗室保存。(2)培養基斜面培養基葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10. Og/L，瓊脂20g/L，pH為6. 5 ；種子培養基葡萄糖20.(^/1，蛋白胨20.(^/1，酵母膏10. Og/L，pH為6. 5 ;發酵培養基葡萄糖15. 0g/L，硫酸銨5. 0g/L，酵母膏2. 0g/L，磷酸二氫鉀1. 5g/L，硫酸鎂 O. 25g/L，pH 為 6· 5 ;(3)斜面培養與保存將多形漢遜酵母(來源為ATCC No. 26012)接種于斜面培養基中培養10 16h得斜面種子，培養溫度為30 37°C ;4°C低溫保存。(4)種子培養將斜面種子在30°C活化3 4h后，取一環多形漢遜酵母菌體接種至裝有30 50ml種子培養基的250ml的三角瓶中培養14 20h得種子培養液，搖床轉速為110r/min，培養溫度為37°C。(5)搖瓶培養(變溫分批發酵)將種子培養液按照10%(v/v)的接種量接種至裝有30 50ml發酵培養基的250ml三角瓶中進行發酵培養得發酵液，發酵培養過程中首先于40 49°C培養10 16h，然后將培養溫度降低為30 40°C繼續培養36 40h，發酵培養過程中搖床轉速為110r/min。(6)胞內谷胱甘肽的提取將一定量的發酵液離心，得到的新鮮酵母用蒸餾水洗滌兩次，加入磷酸緩沖溶液于-20°C冷凍過夜后取出煮沸10min，7000rpm離心IOmin得上清液。(7)谷胱甘肽的測定采用DTNB [5，5' - 二硫雙2_ (硝基苯甲酸)]法。取上述上清液O. 5ml，加入1. 5ml質量分數為O. 06%Na0H水溶液，以及O. 5ml
O.03% (v/v)甲醛水溶液，搖勻，靜置2min，加入2. 5ml DTNB分析液，搖勻，在25°C水浴中保溫5min,測定412nm吸光度。(8)胞內谷胱甘肽含量的定義
權利要求
1.一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于將多形漢遜酵母斜面種子經種子培養后接種在發酵培養基中進行發酵培養，發酵培養過程中首先于40 49°C培養10 16h，然后將培養溫度降低為30 40°C繼續培養36 40h，發酵培養過程中搖床轉速為 110r/mino
2.根據權利要求1所述一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于所述種子培養的培養條件為將斜面種子在30°C活化3 4h后，取一環多形漢遜酵母菌體接種至30 50ml種子培養基中搖床培養14 20h得種子培養液，搖床轉速為110r/min，培養溫度為37°C。
3.根據權利要求2所述一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于所述種子培養基的組成包括20. Og/L葡萄糖、20. Og/L蛋白胨以及10. Og/L酵母膏，種子培養基的pH 為 6. 5。
4.根據權利要求1所述一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，其特征在于所述發酵培養基的組成包括15. Og/L葡萄糖、5. 0g/L硫酸銨、2. 0g/L酵母膏、1. 5g/L磷酸二氫鉀以及0. 25g/L硫酸鎂，發酵培養基的pH為6. 5。
全文摘要
本發明提供一種漢遜酵母發酵生產谷胱甘肽的方法，根據溫度對細胞代謝過程的影響，通過溫度梯度發酵試驗確定酵母細胞的最適生長溫度以及GSH的最適生成溫度，通過最適反應溫度的合理調控，采用變溫發酵，提高GSH的生產水平。本發明提供的GSH發酵技術，產量高，成本低，操作簡便，終產物中GSH可達216.68mg/L，胞內GSH含量達53.37mg/g，相對于恒溫培養分別提高了41.78%和13.53%。
文檔編號C12P21/02GK103014103SQ201210560070
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者錢衛東, 付云芳, 陳宣 申請人:陜西科技大學