專利名稱：高親和力hiv t細胞受體的制作方法
高親和力HIV T細胞受體本發明專利申請是國際申請號為PCT/GB2006/001147，國際申請日為2006年3月29日，進入中國國家階段的申請號為“200680011470. 1”，發明名稱為“高親和力HIV T細胞受體”的發明專利申請的分案申請。本發明涉及對HIV Gag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA_A*0201具有結合特性的T細胞受體(TCR)。該TCR包含至少一個TCRa鏈可變區和/或至少一個TCR β鏈可變區，其對于所述 SLYNTVATL-HLA-A*0201 復合物的 Kd 小于或等于 I μ M和 / 或對 SLYNTVATL-HLA_A*0201復合物的解離速率U為IxKT3S4或更慢。
背景技術：
人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。該病毒是屬于慢病毒群(group)中的一種被膜逆轉錄病毒。SLYNTVATL(SEQ ID NO 16)肽衍生自Gag基因的gl7基因產物，Gag基因是構成人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)的九個基因中的一個。該肽由HLA-A*0201負載，并呈遞到HIV感染細胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA_A2*0201復合物提供了一種TCR可靶向的HIV標記，例如為將細胞毒劑或免疫刺激劑遞送到感染細胞的目的。然而，對于該目的，如果TCR對肽-HLA復合物具有高親和力和/或慢的解離速率將是有利的。發明概述本發明首次提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的親和力(Kd)小于或等于I μ M和/或解離速率U為lxlOl—1或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQ ID NO :1和2時，所述 細胞不是天然T細胞。此類TCR不論單用或是與治療劑一起使用對于靶向遞呈該復合物的HIV感染細胞都是很有利的。發明詳沭本發明提供了一種T細胞受體(TCR)，其對SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結合特性，并包含至少一個TCRa鏈可變區和/或至少一個TCRP鏈可變區，它的特征在于所述TCR對于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的Kd小于或等于I μ M和/或對于SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的解離速率(kj為lxlO—Y或更慢，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQ ID NO :1和2時，該細胞不是天然T細胞。可采用任何已知的方法測定Kd和/或(kj。一種優選的方法是實施例4中的表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance, Biacore)方法。為了比較，通過實施例4的基于Biacore方法測定親本HIV gag TCR(TCRα鏈見SEQ ID NO :9，TCR^鏈見SEQ ID NO 10)的二硫鍵連接的可溶性變體與SLYNTVATL-HLA-A*0201 復合物相互作用的 Kd 約為 85nM，解離速率(koff)為 2. 21 X 1(T2S_1，半衰期為0. 17分鐘。SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的特異性親本HIV Gag TCR具有以下的Va鏈和Ve鏈基因用途α 鏈-TRAV12.2β 鏈-TRBV5.6
可將親本HIV Gag TCR用作模板來產生本發明的其它TCR，所述其它TCR對于所述TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物之間的相互作用的高親和力高和/或解離速率慢。因此，相對于親本HIV Gag TCRa鏈可變區(參見

圖1a和SEQ ID No :1)和/或β鏈可變區(參見圖1b和SEQ ID NO :2)，本發明的TCR在其至少一個互補決定區(⑶R)和/或可變區框架區發生突變。本發明也考慮了本發明TCR可變區中的其它超變區(例如超變4(HV4)區)可在高親和力突變TCR中發生突變。噬菌體展示為產生TCR變體文庫提供了一種手段。(Li等，(2005)NatureBiotech23(3) :349-354)和W02004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫篩選的方法，所述TCR變體各含有非天然鏈間二硫鍵。天然TCR以異二聚化的α β或Υ δ形式存在。然而，現已顯示由單條TCR TCRa或TCR β鏈組成的重組TCR可結合肽MHC分子。在一個實施方式中，本發明的TCR包括α鏈可變區和TCRP鏈的可變區。TCRa鏈序列和/或TCRP鏈序列中的突變可為一個或多個取代、缺失或插入，這對于本領域技術人員而言是顯而易見的。可用任何合適的方法來實現這些突變，這些方法包括但不限于基于聚合鏈式反應(PCR)方法、基于限制性內切酶的克隆方法、或不依賴于連接反應的克隆(LIC )方法。這些方法在許多標準分子生物學教材中有所詳述。關于聚合酶鏈式反應(PCR)誘變法和基于限制性內切酶的克隆法更為詳盡的描述可參見(Sambrook&Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rdEd.)《分子克隆實驗室指南》第三版，CSHL Press)。關于LIC法的進一步描述可見于(Rashtchian，(1995)Curr 0pinBiotechnol6(I) :30-6)。應注意到包含相似Va和νβ基因應用并由此氨基酸序列與HIV Gag相似的任何α β TCR可用來制作便利的模板TCR。然后可能將產生本發明突變的高親和力TCR所需的改變引入編碼模板a PTCR的一個或兩個可變區的DNA中。本領域技術人員顯然知道可通過許多方法，例如定點誘變引入所需的突變。與圖1a和SEQ ID No:1的親本HIV Gag TCRa鏈可變區序列中這些位置的氨基酸相比，本發明TCR包含那些在對應于以下所列的一個或多個TCRa鏈可變區的氨基酸發生突變的TCR。 除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)殘基。本領域技術人員可知該殘基在重組蛋白產生過程中可以除去。本領域技術人員也顯然知道，可將其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5個或更多個殘基，而基本不影響該TCR的pMHC結合性能，本發明包括所有這些不重要的變體。本文所用的術語“可變區”應理解為包括給定TCR的不包含在由TCRa鏈的TRAC基因或TCR β鏈的TRBCl或TRBC2基因所編碼的恒定區內的所有氨基酸(序列)。(《Τ細胞受體手冊》(Τ cell receptor Factsbook), (2001) , LeFranc 和 LeFranc,科學出版社,ISBN 0-12-441352-8)。本文所用的術語“可變域”應理解為包括給定TCR的由TCRa鏈的TRAC基因或TCR^鏈的TRBV基因所編碼的所有氨基酸(序列)。(《T細胞受體手冊》(Tcell receptorFactsbook)，(2001)，LeFranc 和 LeFranc，科學出版社，ISBN0-12-441352-8)。本領域技術人員可知，在本文定義的可變區和恒定區之間交界處由密碼子所編碼的氨基酸中發生變異可導致TCR庫(repertoire)的部分多樣性。例如，存在于親本HIVGag TCR序列中該交界處的密碼子(突變)導致本文可變區序列的C-末端存在組氨酸(H)殘基。該組氨酸取代了圖8a所示，TRAC基因編碼的N-末端天冬酰胺(N)殘基。本發明的實施方式中包括含有對應于以下一個或多個α鏈可變區氨基酸發生突變的突變性TCR :95T、96N、97S、98G和100A，例如以下氨基酸95S 或 G96A97H98D100S以上的編號與圖1a和SEQ ID No:1中所示的編號一致。本發明的實施方案也包括對應于以下所列的一個或多個TCRii鏈可變區氨基酸相對于圖1b和SEQ ID No:2的天然HIV Gag TCR^鏈可變區中這些位置的氨基酸發生突變的TCR。所指示的可能發生突變的氨基酸是51Y、52E、53E和54E，例如5IV 或 A52R 或 L
53G
54V以上的編號與圖1b和SEQ ID No:2中所示的編號一致。本發明的其它優選實施方式是含有圖6所示突變的α鏈可變區氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No: 11到13)。這種TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分。本發明的其它優選實施方式是含有圖7所示突變的β鏈可變區氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No: 14和15)。這種TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分。天然TCR存在異源二聚體α β或Υ δ形式。然而，目前已顯示由α α或β β同源二聚體構成的重組TCR能與肽MHC分子結合。因此，本發明的一個實施方式是TCRa α或TCRP β同源二聚體。本發明的其它優選實施方式是含有下列α鏈可變區氨基酸序列和β鏈可變區氨基酸序列組合的本發明的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分
權利要求
1.一種異二聚化的α-βΤ細胞受體(TCR)，其包含下表所示的α和β鏈可變區對，任選地包含一個或多個表型沉默取代
2.一種包含SEQ ID NO:1所示的TCRa鏈可變區和SEQ ID NO: 15所示的TCRP鏈可變區的TCR，任選在其C-末端和/或N-末端截短1、2、3、4或5個殘基。
3.如權利要求1或2所述的TCR，其包括SEQID NO: 19所示的a鏈恒定區和/或SEQID NO: 20和21所示的β鏈氨基酸恒定區序列之一，任選地包含一個或多個表型沉默取代。
4.如前述任一權利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR不含跨膜和胞質區域。
5.一種異二聚化的α-β T細胞受體(TCR)，其包含SEQ ID NO:27所示的TCRa鏈和SEQ ID ΝΟ:28 所示的 TCRP 鏈，除了 SEQ ID NO:28 第 69-71 位的 YEE 突變為 ALG。
6.異二聚化的α-βT細胞受體(TCR)的編碼核酸，所述TCR包含SEQ IDNO:27所示的TCRa鏈和SEQ ID NO:28所示的TCRP鏈，除了 SEQ ID NO:28第69-71位的YEE突變為 ALG。
7.—種用TCR表達載體轉導的T細胞，所述TCR表達載體包含權利要求6所述的核酸。
8.—種用TCR表達載體轉導的T細胞，所述TCR表達載體包含權利要求1-3中任一項所述的TCR的編碼核酸。
9.一種在其表面展示TCR的T細胞，所述TCR由權利要求6所述的核酸表達。
全文摘要
本發明提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復合物的親和力(KD)小于或等于1μM和/或解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈并包含SEQ ID NO1和2時，所述細胞不是天然T細胞。此類TCR可單獨使用或與治療劑聯用，以靶向于遞呈該復合物的HIV感染細胞。
文檔編號C12N5/10GK103059128SQ20121056391
公開日2013年4月24日 申請日期2006年3月29日 優先權日2005年4月1日
發明者B·K·雅各布森, 李懿, S·M·鄧恩, P·E·莫洛伊 申請人:英美偌科有限公司