專利名稱：一種木聚糖酶及表達木聚糖酶的重組工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種木聚糖酶及表達該木聚糖酶的重組工程菌。
背景技術：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成木糖和低聚糖的一類酶的總稱，通常所說的木聚糖酶即內切β-1，4-木聚糖酶，內切β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖主鏈，隨機切開木聚糖內部的木糖苷鍵，將其分解為低聚糖。不同來源木聚糖酶的組成和性質不完全相同，但理化性質存在相似性，如相對分子質量在O. 8萬-14. 5萬、pH在3-10范圍內穩定，最適范圍為4_7 ；不同來源木聚糖酶等電點在3-10 ;不同來源的木聚糖酶氨基酸組成相差不大等。
小麥和玉米等植物性原料中含有大量非淀粉多糖，特別是阿拉伯木聚糖，而它不能被單胃動物利用。當木聚糖進入畜禽小腸后，部分溶于水，使得食糜含水量增加，從而使小腸內容物的黏度增加，阻礙了營養物質和消化酶的結合及營養物質在小腸黏膜上的吸收，另外食糜黏度的增加抑制了內源消化酶的活性，降低了食糜的通過速率；不溶性木聚糖包裹營養物質也阻礙了營養物質的釋放，降低了營養物質的消化利用率。眾多研究表明添加木聚糖酶能降解木聚糖、減少微生物定植并維持腸道正常結構，提高動物體對營養物質利用率(梁永，2012)。Panbangred和Fukusaki (1985)首次利用大腸桿菌表達矮小芽抱桿菌(Bacilluspumilus Ι0Ρ) β-木聚糖酶。隨后已有數十種不同來源的木聚糖酶基因在原核生物表達系統中實現了表達。目前，對木聚糖酶在不同真核系統中的表達也進行了研究。應用最普遍的真核表達系統是酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統、動物乳腺表達系統、絲狀真菌外源表達系統等。研究證實，酵母表達系統作為成熟的表達系統已使多種不同來源的木聚糖酶實現了聞效表達(張紅連等，2003 ；Moreau等，1992)。

發明內容
本發明的目的是提供一種木聚糖酶及其重組表達工程菌，即利用基因工程技術手段，將煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因轉化入畢赤酵母中，構建畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達木聚糖酶，且生產的木聚糖酶在中性偏酸性條件下具有較高的活性，可廣泛應用于飼料添加劑領域。本發明一方面涉及一種從煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中分離的木聚糖酶，其特征在于I)氨基酸序列為SEQ ID NO 1的木聚糖酶；2)在SEQ ID NO 1中限定的氨基酸中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有煙曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID NO :1衍生的蛋白質。上述的煙曲霉的木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發明還提供用于表達上述木聚糖酶的重組表達載體；所述的重組表達載體攜帶有序列為SEQ ID NO : 2的編碼基因。本發明另一個方面涉及一種用于表達上述木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，該工程菌攜帶有表達煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因的表達載體；該畢赤酵母(Pichia pastoris) ZHEl菌株，已于2012年12月5日保藏于位于武漢洛珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M2012504。本發明另一方面涉及上述畢赤酵母工程菌的應用，用于生產木聚糖酶。本發明構建的畢赤酵母工程菌能高效表達煙曲霉的木聚糖酶基因，搖瓶發酵酶活達到277U/ml。本發明的重組木聚糖酶在中性偏酸性范圍內具有較高的酶活，最適pH值為6.0，在pH 5. 0-7. O的范圍內能保持80%以上的活性；最適反應溫度為55°C，在溫度40-60°C的范圍內，能保持50%以上的活性。通過在日糧中添加本發明的木聚糖酶，肉雞的只采食量、只增重分別提高了 5. 7%U2. 2% ;糞樣中能量含量、蛋白含量比對照組分別降低了 0.7^^2% ;表觀能量利用率提高了 2. 1%，蛋白質表觀利用率提高了 6.6%。本發明的 木聚糖酶可有效提高飼料中營養物質的利用率，從而節約糧食資源和養殖成本，增加生產效益。


圖1 :PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2 :畢赤酵母工程菌發酵上清液SDS-PAGE電泳圖，箭頭所指處為重組木聚糖酶。圖3 :重組木聚糖酶的作用pH-相對酶活曲線。圖4 :重組木聚糖酶的作用溫度-相對酶活曲線。
具體實施例方式下面結合實例對本發明的方法做進一步說明，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。實施例1煙曲霉木聚糖酶基因的克隆1.1引物設計根據NCBI GenBank號為XM746007.1上基因序列設計引物，上游引物為5’AAATACGTAACACCCGGCTCGGAGCAATAC 3’ ；下游引物為5’ AAGCCTAGGCTAAAAACAGTGATAGTAGC 3，。1. 2目的基因ZHEl的PCR擴增以煙曲霉基因組cDNA為模板，利用上下游引物進行擴增，擴增條件為94°C預變性4min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸40s，30個循環后，72°C延伸lOmin。凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，命名為ZHE1，瓊脂糖凝膠電泳(圖1)分析顯示，產物大小為609bp。1.3目的基因測序驗證將擴增產物ZHFl克隆至pMDlS-T載體，送至北京華大基因測序中心進行測序，測得ZHFl的核苷酸序列為SEQ ID NO :2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :1。通過NCBI同源序列比對，確定擴增的基因為木聚糖酶基因。實施例2畢赤酵母工程菌的構建2.1表達載體的構建將擴增得到的木聚糖酶基因ZHEl片段，用快速限制性內切酶Avrll、SnaBI進行雙酶切，IOOuL 酶切體系為PCR 產物 30uL, IOXbuffer IOuL, AvrII5uL, SnaBI 5uL, ddH2050uL。37°C酶切2h后，瓊脂糖凝膠電泳回收片段。將表達載體pPIC9k用快速限制性內切酶AvrI1、SnaBI進行雙酶切，IOOuL酶切體系為載體 25uL，IOXbuffer IOuL，AvrII 5uL, SnaBI 5uL, ddH20 55uL。37°C酶切 2h 后，瓊脂糖膠電泳回收片段。將經限制性內切酶AvrII和SnaBI雙酶切的ZHEl片段和pPIC9k載體相連接構 建表達載體pPIC9k-ZHEl。12uL連接體系為ZHE1片段為3. 5uL，pPIC9k載體為6. 5uL，10XT4DNA ligase bufferl. 2uL, T4 DNA ligase O. 8uL。22 °C 連接 5Η，轉化大腸桿菌DH5 α，涂布含氨芐青霉素終濃度100ug/mL的LB平板，37°C過夜培養。挑取轉化子測序驗證，測序驗證正確的轉化子轉接到LB液體培養基中，37°C過夜培養，提質粒，即為重組酵母表達質粒PPIC9K-ZHE1。2. 2畢赤酵母工程菌的構建及驗證將pPIC9K-ZHEl用PmeII進行線性化，線性化片段用柱純化試劑盒純化后，通過電穿孔法轉化畢赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生長出的菌落即為畢赤酵母工程菌株。挑取單個陽性轉化子轉接于BMGY培養基中，30°C，250rpm振蕩培養Id后，再轉入BMMY培養基中，30°C，250rpm振蕩培養，每天添加O. 5%的甲醇。誘導表達4d后，離心去除菌體，將上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖2所示，工程菌表達的木聚糖酶分子量為20kDa左右，圖2中箭頭所指處即為重組木聚糖酶。將該陽性轉化子命名為畢赤酵母ZHEl (Pichia pastoris ZHE1)，并于2012年12月5日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2012504。將上清液進行木聚糖酶活力測定，結果顯示，搖瓶水平下保藏的工程菌中木聚糖酶的表達量達到277U/ml，從而證明該菌株能夠高效的表達重組木聚糖酶。而且，連續傳代也沒有出現轉入的載體丟失的現象。酶活力檢測方法取2ml濃度為I %的木聚糖底物(pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經pH5. 5乙酸乙酸鈉緩沖液適當稀釋并經37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應30min。反應結束后，加入5ml DNS試劑，混勻以終止反應。然后沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻后，以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光值AF。酶活單位定義在37°C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放
Iμ mol還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位U。酶活計算公式
.[(/], — Ar ) X K + I ,, ,xlF iX N X 1000
Mxt
式中XD為稀釋酶液中木聚糖酶的活力，U/ml ;AF為酶反應液的吸光度；AB為酶空白液的吸光度；K為標準曲線的斜率；(；為標準曲線的截距；Μ為木糖的摩爾質量，150. 2g/mol ；t為酶解反應時間，min ;N為酶液稀釋倍數；1000為轉化因子，Immol=IOOO μ mol。實施例3木聚糖酶的酶學性質測定3.1最適反應pH的測定采用pH值分別為2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，
將發酵的上清液進行稀釋測定，木聚糖底物也分別用對應PH值的緩沖液配制，在37°C下分別進行木聚糖酶活力測定，計算酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結果如圖3所示，本發明的重組木聚糖酶最適反應pH值為6. 0，為酸性木聚糖酶。3. 2最適反應溫度的測定在ρΗ5· 5 條件下，分別測定 30°C、35 V、40°C、45 V、50°C、55 V、60 V、65 V溫度時
發酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度相對酶活曲線。結果如圖4所示，本發明生產的木聚糖酶最適反應溫度為55°C。3. 3溫度耐受性測定用PH5. 5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋發酵上清液，木聚糖底物也用對應pH值的緩沖液配制。在651、701、751下分別處理21^11和5min，然后在37°C，pH5. 5的條件下測定酶活，以未處理的酶活為100%，計算相對酶活。結果如表I所示，65°C處理2min后，木聚糖酶的殘余酶活為22. 61%，70°C處理2min后，殘余酶活為5. 08%，75°C處理后，無酶活。表I重組木聚糖酶溫度耐受性檢測表
權利要求
1.一種木聚糖酶，其特征在于 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的木聚糖酶； 2)在SEQID NO:1中限定的氨基酸中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有煙曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID N0:1衍生的蛋白質。
2.用于編碼權利要求1所述的木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
3.用于表達權利要求1所述的木聚糖酶的重組表達載體；所述的重組表達載體攜帶有序列為SEQ ID NO:2的編碼基因。
4.一種用于表達權利要求1所述的木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，其保藏編號為CCTCCNO: M2012504。
5.權利要求4所述的畢赤酵母工程菌在生產木聚糖酶中的應用。
全文摘要
本發明涉及微生物工程技術領域，具體涉及一種木聚糖酶及其重組表達工程菌。本發明通過將煙曲霉的木聚糖酶基因轉化入畢赤酵母中，構建得到畢赤酵母工程菌，保藏編號為CCTCC NO: M 2012504。該工程菌能高效分泌表達木聚糖酶，搖瓶發酵酶活高達277U/mL。重組木聚糖酶在中性偏酸性范圍內具有較高的酶活，最適pH值為6.0，在pH 5.0-7.0的范圍內能保持80%以上的活性；最適反應溫度為55℃，在溫度40-60℃的范圍內，能保持50%以上的活性。本發明的重組木聚糖酶可廣泛用作飼料添加劑，能有效提高營養物質的利用率。
文檔編號C12N1/19GK103013958SQ20121056284
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年12月21日
發明者肖志壯, 張霞, 王海, 李冬冬 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司