專利名稱：一種水稻分子標記方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的分子標記方法。
分子標記是一種DNA分子水平上的識別記號，用于識別特定基因和DNA片段的有無及所在位置等。現在廣泛使用的分子標記方法中，與本發明較接近的方法有兩種Ⅰ．隨機擴增多態性DNA(RandomAmplified Polymorphic DNA)，簡稱RAPD，該技術也稱為隨機引物PCR擴增(Arbitrary Primed PCR)，簡稱AP-PCR；Ⅱ．DNA擴增指紋分析(DNA Amplified Fingerprinting)，簡稱DAF。這兩種方法的基本原理相似，均以隨機引物PCR擴增為基礎，即所用引物是任意的，引物的設計不需要預先知道DNA的序列，可以任意設計。兩種方法的主要差別在于所用引物的長度上。RAPD使用的引物長度為10個核昔酸；DAF的引物為5～8個核苷酸。它們的共同優點是引物設計容易、操作簡單、應用成本低。共同缺點是擴增結果的穩定性較差，在一些生物材料中，如水稻，擴增帶的多態性(即有差異的擴增帶)較低。與RAPD相比較，DAF擴增帶的多態性高一些，但穩定性最差，因此現已很少使用。RAPD擴增帶的多態性雖然比DAF低一些，但穩定性高一些，加之引物設計容易，操作簡單、使用成本低等優點，所以至今仍是所有分子標記方法中使用得最廣泛的方法。
在基于PCR擴增的分子標記方法中，引物的長度越長，所能承受的復性溫度就越高，其擴增的結果也就越穩定。而上述RAPD等方法所使用的引物長度都較短，均在10個或10個核苷酸以下，需要較低的復性溫度(35℃左右或更低)來維持配對，這不僅會增加非特異性擴增的機會，對溫度的變化也較為敏感，因而很容易產生出不穩定的擴增產物。這就是導致上述方法結果不穩定的主要原因。因此，增加引物的長度，提高復性溫度就是解決問題最簡捷的方法。
本發明的目的是保留上述RAPD等方法的優點，克服其缺點，提供一種主要適合于水稻的，并又同時具有穩定可靠、操作簡單、多態性高、應用成本低等優點的分子標記新方法，用于水稻的遺傳圖譜、基因定位及水稻的新品種選育研究。
本發明可以通過以下方式得以實現本分子標記方法由引物設計、引物合成、DNA提取、DNA擴增和擴增結果的電泳等步驟組成。在引物的設計中，將10個核苷酸長度的引物增加到14～18個核苷酸的長度。引物的核苷酸組成和排列順序按照隨機的方式設計，但引物中G、C堿基的含量占較高的比例，為60～80％，最佳是65～70％。設計引物時要避免如CCCC、AAAA等連續4個及以上相同堿基序列的出現。引物中最好不含有限制性內切酶的位點，如CCGG、AAGCTT等。引物設計完成后，按照設計的引物序列合成引物，合成引物后，即可進行DNA的擴增。首先提取待測樣品的DNA，現已報道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種。然后在0.2ml的PCR擴增專用薄壁管中，依次加入10～40ng待測樣品DNA,20ng引物，2mM MgCl2,4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM及1個單位的taq聚合酶，反應總體積為25μl。除待測樣品DNA和引物外，各試劑(dNTP、tap酶等)及實驗用品(薄壁管、吸管、吸頭等)均在專業公司購買。將加好樣的薄壁管放入PCR循環儀進行擴增反應。擴增條件為95℃下變性45秒；在45～60℃下復性60秒；72℃延伸45秒；循環30次。擴增結束后，取3μl擴增產物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上，60V下恒壓電泳2小時。用銀染法對凝膠進行染色，以顯示擴增帶。
本發明與RAPD等方法相比較，不僅提高了擴增帶的穩定性和可重復性，而且提高了擴增帶的多態性。并且，還保留了RAPD等方法操作簡單，運行成本低的優點。
實施例1．引物的設計與合成本發明最佳引物長度為16個核苷酸，其中G和C堿基占11個，A和T堿基占5個，堿基的順序按照隨機的方式排列。引物中要避免如CCCC、AAAA等連續4個及以上相同堿基序列的出現，并且最好不含有限制性內切酶的位點，如CCGG、AAGCTT等。設計好的引物由專業的DNA合成公司合成。本發明的引物由賽百盛公司合成。
2．DNA的提取本發明以水稻為材料提取DNA,DNA的提取按照盧揚江等(中國水稻科學，1992,6:47～48)報道的水稻DNA提取方法進行。
3．DNA的擴增在0.2ml的PCR擴增專用薄壁管中，加入20ng的水稻DNA,20ng引物，2mM MgCl2,4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM及1個單位的taq聚合酶，反應總體積為25μl。除水稻DNA和引物外，本發明使用的各種試劑(dNTP、tap酶等)及實驗用品(薄壁管、吸管、吸頭等)均購自華美生物工程公司。
DNA的擴增在Biometra公司的UNO Ⅱ熱循環儀上進行。擴增條件為95℃下變性45秒；52℃復性60秒；72℃延伸45秒；4．擴增結果的電泳取3μl擴增產物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上，60V下恒壓電泳2小時。用銀染法對凝膠進行染色顯帶。銀染按照Caetano-Anollés等(Bio/Technology,1991,9:553～557)報道的方法進行。
權利要求
1.一種由引物設計、引物合成、DNA提取、DNA擴增和擴增結果的電泳等步驟組成的分子標記方法，其特征是引物長度為14～18個核苷酸。
2.根據權利要求1所述的分子標記方法，其特征是引物長度最佳為16個核苷酸。
3.根據權利要求1所述的分子標記方法，其特征是引物中G、C堿基的含量為60～80％。
4.根據權利要求3所述的分子標記方法，其特征是引物中G、C堿基的最佳含量為65～70％。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的分子標記方法，主要應用在水稻遺傳研究方面。
全文摘要
本發明公開了一種水稻分子標記方法,針對目前所采用的方法中擴增帶的穩定性、重復性和多態性不高,通過改變引物核苷酸長度,達到不僅提高了擴增帶的穩定性和可重復性,而且提高了擴增帶的多態性的目的,同時,還具有操作簡單,運行成本低的優點。
文檔編號C12Q1/68GK1308134SQ0110704
公開日2001年8月15日 申請日期2001年1月16日 優先權日2001年1月16日
發明者羅科 申請人:中國科學院成都生物研究所