專利名稱：一株活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及其應用，具體涉及一株蠟狀芽孢桿菌{Bacilluscereus)m~l及其在活化土壤養分、提高土壤肥力、改善土壤微生態結構，進而促進農作物生長方面的應用。
背景技術：
在農作物生長過程中，主要的營養元素，如N、P、K等絕大部分都是通過根系從土壤中吸收，N、P、K營養供應充足與否是制約其實現潛在生產能力、發揮生態效能的主要限制因素之一。為了滿足植物 生存所需的N、P、K等營養元素，工業化肥一直被認為是實現這一目的的主要途徑。然而，隨著化肥使用量的不斷增大，負面影響日益明顯，如成本高、對非再生能源消耗大，污染空氣、土壤及水質、危害農牧業等食品安全，破壞土壤結構及微生物區系和多樣性等。隨著根際微生物的研究，人們發現植物根際存在具有生物固氮、溶磷、解鉀及分泌植物激素的菌株。一般而言，根際促生細菌是指生存在植物根圈范圍中，對植物生長有促進或對病原菌有拮抗作用的有益的細菌統稱，其促進植物生長的作用及機理一般可以概括為以下幾個方面:(I)分泌植物促生物質；(2)改善植物根際的營養環境；(3)對作物病害的生物控制作用；(4)對污染物的降解等。磷素是植物生長不可缺少的三大營養元素之一，對作物生長十分重要。農作物要獲得高產，就必須向土壤中補充磷肥。由于土壤中含有大量的鐵、鋁等金屬離子，施入土壤中的水溶性磷肥很快被這些離子固定，喪失其有效性，致使土壤中施入的磷肥有759Γ90%都變成難溶的無效磷沉積在土壤中，導致磷肥的當季利用率僅為109Γ25%。氮肥是農業增產中效果最突出的一類肥料，對農業生產一直發揮著重要作用。在I960 - 1995年間，全球氮肥施用量增長了 7倍，到2050年將繼續增長3倍。我國擁有占全球7%的耕地面積，養育著占全球22%的人口，為滿足糧食增長的需求，中國化學氮肥年消耗量約占全球的30%，成為全球氮肥施用最多的國家。在氮肥大量投入的同時，肥料效益降低的問題日益突出。據估測，我國氮肥的平均吸收率僅為309Γ35%，一般比發達國家低1(Γ15個百分點，而且氮肥過量使用造成的環境壓力也越來越引起人們的關注。為了解決土壤養分的有效性低及其過量施用的問題，目前實際可行的辦法就是在土壤中施入微生物菌肥，利用其中的活化菌株將土壤中難溶態養分轉化為植物可利用態。鑒于活化土壤養分微生物的種類多樣，且不同菌株之間的活化能力有較大差異，高效活化養分菌的篩選工作尤為重要。目前研究的活化養分菌多為好氧菌，缺氧菌也有少量報道，而能在好氧和缺氧條件下皆具有高效提高土壤肥力和促進農作物生長功能的活化養分菌尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一株可以在好氧和缺氧條件下活化土壤養分的細菌，該菌能夠有效提高土壤中磷和氮的有效性，提高土壤的肥力，促進農作物的生長，從而提高肥料的利用率，節約礦產資源，改善生態環境，有利于農業生產的可持續發展。本發明的另一目的是提供上述菌株的應用。本發明通過以下技術方案實現上述目的:
本發明通過分離篩選得到一株蠟狀芽孢桿菌(Bacillus carets)NC-1，簡稱NC-1菌。該菌株已于2012年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.6127，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。本發明分離的蠟狀芽孢桿菌NC-1的生物學特征:
該菌株篩選自廣東省廣州市華南農業大學農場水稻根際土壤中，為革蘭氏陽性菌，在牛肉膏蛋白胨培養基上培養12h，在顯微鏡下觀察菌體以單個排列；培養24h，菌體以單個、成對或鏈狀排列，芽孢中生或近中生，芽孢數90%以上，芽孢形成后菌體不膨大，菌體為桿狀，無莢膜，有運動性，好氧或兼性。在營養瓊脂培養基上培養24h后形成的菌落為圓形或近似圓形、質地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落。經過序列測定，該蠟狀芽孢桿菌NC-1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所
/Jn οNC-1菌的培養方 法，其培養基的成分為牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂18.0g,蒸餾水IOOOmL,或按照此比例配制成的培養基，pH值為7.(Γ7.2。菌株保藏按常規菌種保藏溫度保藏。上述NC-1菌可以增加土壤中磷的溶解性，尤其對于難溶性無機磷，效果顯著，使土壤中有效磷含量大大提高，該NC-1菌可用于增加土壤磷有效性。上述NC-1菌還可以用于促進農作物如玉米和/或水稻的生長。該NC-1菌還能夠增加土壤微生物活性、增加土壤微生物群落多樣性和均勻度，和優化土壤微生物群落組成。基于NC-1菌以上各方面的功能及用途，可以將其制備成生物菌劑或生物肥料。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
發明人經過大量的實驗研究，篩選出蠟狀芽孢桿菌cereus NC-1。該菌株不僅可以活化土壤養分，提高肥料的有效性及利用率，還可以促進農作物的生長，提高土壤微生物的多樣性，對節約礦產資源、改善土壤微生態環境和促進土壤可持續利用具有重要的意義。


圖1.NC-1菌革蘭氏染色顯微照片。圖2.NC-1菌芽孢染色顯微照片，圖中藍色部分為芽孢。圖3.不同菌株在磷酸鈣培養基下產水溶性磷含量的對比圖，橫坐標為菌株編號，縱坐標為水溶性磷濃度。圖4.不同菌株在磷酸鈣培養基下產微生物磷含量的對比圖，橫坐標為菌株編號，縱坐標為微生物磷濃度。圖5.為NC-1菌促進玉米生長盆栽效果對比圖。
圖6.為NC-1菌促進水稻生長盆栽效果對比圖，左邊三盆為CK組，右邊三盆為NC-1 組。圖7.為NC-1菌處理土壤微生物群落AWCD值變化曲線圖，CK為對照組。圖8.為NC-1菌處理土壤細菌DGGE指紋圖譜，CK為對照組。
具體實施例方式實施例1蠟狀芽孢桿菌NC-1的分離、純化和鑒定 (I)分離
配制難溶無機磷培養基:葡萄糖10.0g,硫酸銨0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，七水硫酸亞鐵0.03g,四水硫酸錳0.03g,酵母膏0.4g，磷酸鈣5g，蒸餾水1L，pH值7.0 7.5。以廣東省廣州市華南農業大學農場水稻田采集的土壤為篩選土樣，采用平板涂布法，準確稱取待測土樣10.0g,放入裝有90mL無菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，搖床振蕩30min，使微生物充分分散，靜置2(T30s，取上清液進行10倍遞減稀釋，采用103 105稀釋度，用移液槍分別移取稀釋液0.lmL，涂布在難溶無機磷培養基平板上，28°C倒置培養7d，逐日觀察溶磷圈，記錄溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直徑(D)。篩選出有解磷圈的細菌菌株編號為a_3、a_4、a_5、a_6、a_7、a_8和a_9菌,其中a_8的解磷效果最強,對a_8菌進行純化。(2)純化營養瓊脂培養基:牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂18.0g,蒸餾水1L，pH值
7.0 7.2。將篩選出的a_8菌菌株利用平板劃線法純化后，保存于營養瓊脂培養基斜面上。實施例2特性鑒定
(I)菌體形態特征
a-8菌為革蘭氏陽性菌，有芽孢，芽孢形成后菌體不膨大。菌體為桿狀，無莢膜，有運動性，需氧。革蘭氏染色效果見圖1，菌體被染成藍紫色，芽孢未著色。芽孢染色效果見圖2，菌體呈黃棕色，芽孢為淺藍色。(2)菌落形態特征
在營養瓊脂培養基上形成的菌落為圓形或近似圓形、質地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落。(3)分子生物學特性
米用 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒(Bio-rad 公司)提取細菌總 DNA。米用細菌 16S rDNA 通用引物 F63 (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC, SEQ ID N0:2)和 R1087(CTC GTTGCG GGA CTT ACC CC, SEQ ID NO: 3)，常規PCR擴增細菌的 16S rDNA，在 IOOObp 附近出現明顯的條帶，將PCR擴增產物回收后進行序列測定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blast程序對數據庫中的所有序列進行比較分析，結果發現本發明菌株的16S rDNA序列和與GenBank中蠟狀芽孢桿菌具有較高的同源性，其相似度為100%。結合上述的菌落形態、16S rDNA序列分析的結果以及參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行生理生化實驗，鑒定該菌株為臘狀芽抱桿菌cereus),命名為臘狀芽抱桿菌cereus NC-1,簡稱NC-1菌。實施例3 NC-1菌在難溶性無機磷培養基培養下的產水溶性磷的效果實驗三角瓶中裝入50mL已滅菌的難溶無機磷培養基(磷酸鈣的濃度為5.0g/L)，分別加入實施例1中的分離步驟所篩選出的a-3、a-4、a-5、a-6、a-7、a_8 (即NC-1菌)和a_9菌(接種量5環)，制成菌液后28°C，70rpm，搖床培養7d。將培養后的菌液在10000rpm、4°C離心15min，取上清液用鑰銻抗比色法測定水溶性磷含量(單位為mg/L，即表示每升樣品中所含水溶性磷的毫克數)，設不接任何菌的培養基為對照，每個處理重復3次。試驗結果見表I和圖3。結果表明:NC-1菌的水溶性磷含量最高，達到100.62mg/L。表I不同 菌種處理的水溶性磷含量(mg/L)
權利要求
1.一株活化土壤養分的臘狀芽孢桿菌，名稱為臘狀芽孢桿菌(ifeci77i/5.cereus)NC-1，于2012年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號 CGMCC N0.6127。
2.根據權利要求1所述活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌，其特征在于其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.權利要求1或2所述活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌的培養方法，其特征在于培養基的成分為牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂18.0g,蒸餾水IOOOmL,或按照此比例配制成的培養基，PH值為7.(Γ7.2。
4.權利要求1或2所述活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌在增加土壤磷有效性中的應用。
5.權利要求1或2所述活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌在促進玉米或水稻生長中的應用。
6.權利要求1或2所述活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌在增加土壤微生物活性、增加土壤微生物群落多 樣性和均勻度，和優化土壤微生物群落組成中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株活化土壤養分的蠟狀芽孢桿菌及其應用。該菌株于2012年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC No.6127，其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。該菌能夠明顯活化土壤養分，提高土壤磷和氮有效性，改善土壤微生物群落組成，提高土壤微生物群落多樣性和均勻度，提高土壤微生物代謝活性等，從而提升土壤肥力，進而促進農作物生長，有利于農業的可持續發展和利用，在生產實踐中具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12R1/085GK103173380SQ201210573809
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年7月2日
發明者蔡燕飛, 李永濤, 孫禮勇, 黃娟, 孔德穎, 趙鳳儀 申請人:華南農業大學