一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種。蠟蚧菌（Lecanicilliumsp.）ZJLSP07，已于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC?No.7803。本發明的蠟蚧菌ZJLSP07對柑橘木虱具有致病力，與同屬的蠟蚧輪枝菌菌株相比，蠟蚧菌ZJLSP07對柑橘木虱具有更強的作用效果，可被開發為生防菌制劑用于對柑橘木虱的生物防治。與目前防治柑橘木虱的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無污染、不易產生抗藥性等特征，具有良好的市場應用前景。
【專利說明】一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬(.LecaniciIlium )真菌新種。 【背景技術】
[0002]柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing, HLB)是當前柑橘生產上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害，廣泛分布在亞洲、非洲和美洲等多個國家和地區。該病害的猖獗發生和蔓延危害，給人們帶來了巨大的經濟損失，已成為柑橘產業穩定發展的重大障礙。盡管從發現該病害至今已有百余年的歷史，但目前尚缺乏有效的防治藥劑和理想的抗病品種，因此主要采取以治蟲防病為主的綜合防控措施來控制該病害的發生和流行。該病害的病原物為韌皮部桿菌屬Liberibacter)細菌,在自然條件下主要通過柑橘木風(.Diaphorina ci tri )傳播擴散。柑橘木風除作為唯一自然蟲媒傳播黃龍病外，還是柑橘、朽1檬、黃皮、九里香、枸杞等蕓香科植物新梢期的主要害蟲，可直接取食危害新梢嫩葉及產生分泌物誘發煤煙病等。因此，加強對柑橘木虱的防治，無論對于控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲體本身對柑橘的危害都具有重要的意義。
[0003]目前對于柑橘木虱的防治多采用化學防治措施，然而化學農藥的頻繁使用造成了農藥殘留、環境污染、生物多樣性破壞和柑橘木虱產生抗藥性等諸多問題，而生物農藥以其高效、低毒、低殘留、無污染、不易產生抗藥性和原料易得等特性被人們認為是未來化學農藥的理想替代藥劑。因此，利用生物農藥防治柑橘木虱也逐漸引起人們的重視。已有報道對柑橘木風具有致病效果的真菌有檬形被毛孢(Mirsu tella ci tri formi s )、宛氏擬青霉 ipaecilomyces variο ii )、玫煙色擬青霉{Paecilomyces fumosoroseus )、球抱白僵菌iBeauveria bassiana )、蟲牙笑頂?包霉(乂crostalagmus aphit/ia?)、黃色鍵刀菌 QFusariumcuImorum)和臘階輪枝菌(.LecaniciIlium Iecanii )等。
[0004]臘階菌屬是從先前的Ke_riici77itt? 屬的section Prostrata離出來的一個屬。最初Gams等根據菌株的培養特征和形態學特征將Verticillium屬真菌分為 5 個部分，分另 Il 為 section Verticillium^ section Nigrescen tia > sectionProstrata、section Albo~erecta 及 residual group。 其中 section Verticillium只包括一個菌種 Verticillium tenerum ；section Nigrescentia 包括模式菌種Verticillium nigrescens 及 Verticillium albo_atrum、Verticillium dahliae、Verticillium nubiIum、Verticillium tricorpus、Verticillium theobromae ；sectionProstrata包括18個菌種，模式菌種為Cordyceps mi Ii tar is的無性型，及最常見的菌f中 Verticillium Iecanii 矛口 Verticillium psalliotae ;section Albo—erecta 的模式菌種為VerticiIliumfungicola ;剩余未劃入上述部分中的VerticiIlia?屬真菌菌種則歸入到residual group。之后Zare等和Gams等又根據菌種的形態學特征和核糖體DNA內轉錄間隔區(ITS)、核糖體大亞基(LSU)、核糖體小亞基(SSU)、β-tubulin等基因序列及菌種的寄主種類，對屬真菌重新進行了歸類，而尚未重新進行分類的屬真菌菌種仍然沿用以前的名字。洛Verticillium sectionVerticillium 中的 Verticillium tenerum (同義 Verticillium Iuteoalbum^ 歸入^lJ Acrostalagmus 屬中；嘗 Verticillium section Nigrescentia 中的 Verticilliumnigrescens 歸入到 Gibellulopsis 屬中；嘗 Verticillium section Nigrescentia 中白勺 Verticillium theobromae 歸入至Ij M Musicillium 中；M Verticillium sectionNigrescentia 中作為植物病原菌的 Verticillium dahliae、Verticillium 1ngisporum^Verticillium albo-atrum、Verticillium nub Hum 矛口 Verticillium tri corpus 仍保留在 Verticillium 屬中，形成狹義上的 Verticillium 屬 Verticillium s.str.；將Verticillium section Prostrata 劃分成 5 個屬，% LecaniciIliumΛSimpliciIliumΛPochonia、Haptoc i I Iium 取 Rot iferophthora，其中 Verticillium section Prostrata一大部分菌種劃入到LecaniciIli —屬中，LecaniciIli訓?屬真菌多為侵染昆蟲和真菌的菌種，Simplicillium屬真菌多為腐生菌和真菌的重寄生菌，Pochonia屬真菌多寄生孢囊線蟲和黏菌，Haptocillium屬真菌的寄主多為自由生活型線蟲，Rotiferophthora屬真菌多侵染輪蟲。之后，隨著人們研究的進展，不斷有新發現和命名的菌種歸入到上述各屬中，如Patrik Inderbitzin等將新發現的5種植物病原菌Verticillium isaaci1、Verticillium klebahni1、Verticillium z are gam si an um, Verticillium alfalfae 矛口Verticillium nonalfalfae 歸入到 Verticillium 屬中；Kenichi Nonaka 等將新發現的 5 f中 M Simplicilliumcylindrosporum^ SimpliciIlium minatense^ Simplicilliumsubtropicum^ SimpliciIlium aogashimaense 矛口 Simplicillium sympodiophorum歸入到 Simplicillium 屬中；Nampi ah Sukarno 等將新發現的菌種 Lecanicillium3,Τ3,--θ?οοΙο,Λ Lecanicillium kalimantanense, Satoru Kaifuchi 等將新發現的菌種Lecanicillium primulInumj 及 Kope 等將新發現的菌種 LecaniciIlium pissodis,全都歸入到LecaniciIli訓?屬中。目前LecaniciIli訓?屬共包含22已命名的菌種，分別為 Lecan i c i 11 iumacerosum、Lecanicillium anti I Ianum、Lecanicilliumaphanocladi1、LecaniciIliumaranearum、LecaniciIliumaraneicola、LecaniciIliuma t tenua turn、Lecani ci Ili umdimorphu m、Lecani cilli umfla vi dum、Lecani ci Ili umfungi cola var.fungi cola Λ Lecani ci Ili umfungi cola var.aleophilum、Lecani ci Ili umfusi sporum ΛLecaniciIliumkaliman tanense、LecaniciIliumlecani1、LecaniciIliumlongisporum、Lecanicilliummuscarium、LecaniciIliumnodulosum、Lecanicilliumpissodis、Lecani ci Ili umpri mu I in um、Lecani ci Ili umpsalli o tae、Lecani ci Ili umsaksenae、LecaniciIliumtenuipes、LecaniciIliumwallacei，及 4 個未具體命名的菌種，分別為Lecanicillium sp.X^Lecanicillium sp.!^Lecanicillium sp.^Lecanici I Hum sp.4。
[0005]目前已有研究報道的對柑橘木虱具有致病力的蠟蚧菌屬真菌有蠟蚧輪枝菌{Lecanicillium和刀抱輪枝菌psalliotae)。對于柑橘木風生防菌的研究多處于實驗室階段，在農業生產中利用生防菌制劑成功防治柑橘木虱的實例尚未有見報道。因此，對柑橘木虱蟲生真菌進行進一步分離篩選和生防潛能深入研究，對于促進將來柑橘木虱生物防治的順利開展具有重要的意義。
[0006]
【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種，該菌種具有被開發為生物農藥的潛能，具有良好的市場應用前景。
[0008]一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種，其特征在于該真菌菌株為蠟蚧菌Uecanicilliuni sp.) ZJLSP07,已于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.7803。
[0009]蠟蚧菌Z幾SP07是從浙江省臺州市黃巖區的橘園中采集的柑橘木虱蟲體上分離獲得的，該菌株的形態特征、培養特性、ITS1-5.8S rDNA-1TS2 (核糖體DNA內轉錄間隔區
1-5.8S rDNA-核糖體DNA內轉錄間隔區2)序列和菌種分類結果如下:
1、菌株ZJLSP07的形態特征:如圖1所示，菌株ZJLSP07在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上生長良好，25°C下暗培養7 d其菌落直徑可達2.6-2.7 cm，菌落呈圓形，菌落正面為白色絲絨狀，背面呈淺黃色，具放射狀皺褶，無滲出液和色素產生。如圖2所示，在光學顯微鏡下觀察其菌絲透明，有分隔，寬為1.2-2.2 μ m ;瓶梗著生于匍匐狀氣生菌絲上，單生或對生，少數為輪生，瓶梗從基部向頂端逐漸變細，直立，大小為12.5-28X0.5-1.9 μ m ;分生孢子單生于瓶梗頂端，壁光滑，大小不一，呈橢圓形、紡錘形或鐮刀形，其中大分生孢子大小為
5.5-8.5X1.5-2.5 μ m，小分生孢子大小為3.0-4.5X 1.0-2.0 μ m;未見厚垣孢子。
[0010]2、菌株ZJLSP07的生物學特性:菌株ZJLSP07在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養基、沙氏葡萄糖酵母浸膏瓊脂(SDAY)培養基、察氏(CDA)培養基、麥芽浸膏瓊脂(MEA)培養基、LCA培養基和沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養基上均生長良好，其中在LCA和PDA等培養基上生長 較快，而在PSA培養基上生長相對較慢。在LCA培養基上菌絲相對稀疏，菌落背面無皺褶，而在其他培養基上菌絲較為致密，菌落背面具不同程度的放射狀皺褶。菌株ZJLSP07在10°C~35°C的溫度條件下均可生長，其中25°C~30°C為其適宜生長溫度，10°C條件下生長極為緩慢，5°C和40°C條件下不生長。光照時間長短對菌株ZJLSP07的生長影響不顯著。沙氏葡萄糖酵母浸膏(SDY)液體培養基和沙氏葡萄糖(SD)液體培養基為菌株ZJLSP07最佳產孢培養基。菌株ZJLSP07的分生孢子在10°C~35°C的溫度條件下均能萌發，其中25°C~30°C為其孢子萌發的適宜溫度。
[0011]3、菌株ZJLSP07的基因序列特征:測序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如 SEQ ID NO:1 所示，ITS1-5.8S rDNA_ITS2 完整序列如 SEQ ID N0:2 所示，β -tubulin基因部分序列如SEQ ID N0:3所示。利用NCBI Blast進行比對分析發現，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列與GenBank中多個不同菌種對應序列的相似性達99%~100% ；在GenBank中與其ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性較高的真菌為含蠟蚧菌屬在內的肉座菌目(Hypocreales)真菌，但在序列覆蓋率100%的條件下，菌株ZJLSP07與GenBank中已確定種名的真菌的序列相似性最高僅為94% ;而其β -tubulin基因的部分DNA序列與GenBank中菌種對應序列的相似性最高僅為87%，該基因的編碼區序列(⑶S)與GenBank中菌種的相應序列的相似性最高為95%。利用EMBOSS Needle在線工具對菌株ZJLSP07的基因序列與蠟蚧菌屬各菌種的對應序列進行比對，結果顯示菌株Z幾SP07與蠟蚧菌屬真菌具有較高的同源性，其18S rDNA部分序列的相似性在97.8%和98.7%之間；而其ITS1-5.8S rDNA-1TS2完整序列與蠟蚧菌屬真菌的對應序列相似性最高僅為93.9%。系統發育分析顯示(如圖3)，菌株ZJLSP07與所有的蠟蚧菌屬真菌聚成一個大的分支，且其與Lecani ci Ili umkaliman tanense 和 Lecanicilliumwallacei 具有最近的親緣關系，但在置信度95%下，菌株ZJLSP07與這兩種菌又歸屬于兩個不同的小的分支中。菌株ZJLSP07與蠟蚧菌屬真菌已知的β -tubulin基因的DNA序列相似性最高為84.0%，編碼區序列相似性最高為93.8%。
[0012]參考相關文獻中關于蠟蚧菌屬及屬內各菌種的詳細描述，結合以上對于菌株ZJLSP07的形態特征、生物學特性及寄主種類的研究結果，明確菌株ZJLSP07具備蠟蚧菌屬真菌的典型特征，因此將其鑒定為肉座菌目蟲草菌科(Cordycipitaceae)臘階菌屬的真菌，但其與該屬中已知種的特征又存在差異。對菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列分析結果亦表明，菌株ZJLSP07與蠟蚧菌屬真菌具有較高的同源性，在系統發育樹中與該屬的所有菌種聚為一個分支，進一步表明菌株ZJLSP07為蠟蚧菌屬真菌。但菌株ZJLSP07與蠟蚧菌屬中菌種的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性最高僅為93.9%，遠低于97%這一真菌種間序列相似性的閾值。在系統發育樹上，菌株ZJLSP07與其親緣關系最近的 LecaniciIliumkaliman tanense 和 LecaniciIliumwallacei 也分處于兩個不同的小的分支中。且其β-tubulin基因的DNA序列與GenBank中已知菌種具有較低的相似性。綜合以上研究和分析結果，我們確定菌株ZJLSP07為肉座菌目蟲草菌科蠟蚧菌屬真菌的一個新種，將其命名為蠟蚧菌ZJLSP07。
[0013]進一步的，所述的蠟蚧菌屬真菌新種，其特征在于制備用于防治柑橘木虱的生物藥劑。
[0014]蠟蚧菌ZJLSP07在制備用于防治柑橘木虱的生物農藥中的應用，蠟蚧菌ZJLSP07的分生孢子懸浮液對柑橘木虱具有致病力，接種后第3 d，蠟蚧菌Z幾SP07對柑橘木虱的LC5。為 5.25 X IO9 spores/mL,臘階菌 ZJLSP07 濃度為 LOXlO8 spores/mL 抱子懸浮液對柑橘木虱的LT50為3.25 d。溫室條件下以濃度為1.0X108 spores/mL的蠟蚧菌ZJLSP07的分生孢子懸浮液處理柑橘木虱，在第9 d其校正死亡率可達100%。
[0015]
與現有技術相比，本發明的優點和有益效果為:
(1)本發明所提供的蠟蚧菌Z幾SP07為蠟蚧菌屬真菌的一個新種，國內外無相關的研究報道；
(2)本發明提供的蠟蚧菌Z幾SP07是從浙江省臺州市黃巖區柑橘園中被侵染的柑橘木虱蟲體上分離獲得的，經測定其對柑橘木虱具有致病力；
(3)同等條件下，本發明所提供的蠟蚧菌Z幾SP07較與之同屬的蠟蚧輪枝菌菌株對柑橘木虱具有更強的作用效果，同時間內對柑橘木虱的致死率更高；
(4)本發明所提供的蠟蚧菌Z幾SP07是一種昆蟲病原真菌，其分生孢子懸浮液可直接作用于柑橘木虱，較目前防治柑橘木虱的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無污染和不易產生抗藥性的特征；
(5)蠟蚧菌ZJLSP07培養快，產孢量大，孢子萌發率高，易于制備。
[0016]因此蠟蚧菌ZJLSP07在被開發為生防菌制劑用于對柑橘木虱的生物防治上，具有良好的市場應用前景。
[0017]【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為蠟蚧菌ZJLSP07在PDA培養基上培養7 d后的菌落特征。
[0019]圖2為光學顯微鏡下觀察的蠟蚧菌ZJLSP07的菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態特征。
[0020]圖3為基于ITS1-5.8S rDNA_ITS2基因序列構建的蠟蚧菌ZJLSP07的系統發育樹，圖中“Z.”為蠟蚧菌屬名“LecimicUliumv的縮寫，“V.”為屬名“Verticillium”的縮寫，“義”為屬名“SimpliciIlium”的縮寫，“H.”為屬名“HaptociIlium”的縮寫，“/?.”為屬名“Rotiferophthora” 的縮寫，“P.” 為屬名 “Pochonia” 的縮寫，“M.” 為屬名 “MusiciIlium”的縮寫，”為戳名“Acrostalagmis”的縮寫，”為屬名“Gibellulopsis”的縮寫，括號中的號碼為對應菌種在GenBank中的登錄號。
[0021]圖4為體視顯微鏡下觀察的蠟蚧菌ZJLSP07對柑橘木虱的侵染情況。
[0022]圖5為掃描電子顯微鏡下觀察的蠟蚧菌ZJLSP07的菌絲體在柑橘木虱體表的覆蓋情況及新形成的分生孢子。
[0023]圖6為光學顯微鏡下觀察的蠟蚧菌ZJLSP07的菌絲在柑橘木虱體腔內的分布。【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本發明做進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。
[0025]一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種，菌種命名為ZJLSP07，分類命名:蠟蚧菌(Zeca/?ici77i應sp.)，其保藏編號:CGMCC N0.7803，保藏日期:2013年6月24日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微 生物研究所。
[0026]實施例1:昆蟲病原菌的分離和篩選
1、病菌的分離純化:從浙江省臺州市黃巖區柑橘園內采集柑橘木虱蟲尸，于實驗室超凈工作臺中進行如下操作:先將蟲體放于70%乙醇中浸泡30 S，再經過0.1%升汞浸泡3min，最后用無菌水沖洗3次。用無菌濾紙吸干蟲體上的水分，然后將其放于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(配制方法為:稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸半個小時，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121°C，高壓滅菌20 min)中。將培養皿置于微生物培養箱中25°C恒溫培養，至蟲體周圍長出菌絲后，挑取菌絲轉至新的PDA平板上培養(重復此操作2~3次)，持續培養10 d左右，待菌落上產生分生孢子，用無菌水洗脫分生孢子制備成分生孢子懸浮液，然后參照《植病研究方法》中所述的稀釋純化法(方中達.植病研究方法(第三版)[M].北京:中國農業出版社，1998: 122-140)對病菌進行單孢分離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養基中，培養5 d左右，置于4 °C冰箱保存。
[0027]2、致病菌的篩選:將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，于25°C恒溫培養10 d左右后，以無菌水洗脫菌落上產生的分生孢子，制備獲得分生孢子懸浮液，向其中加入適量的吐溫-80至終濃度為0.1%。取于溫室飼養的30頭健康柑橘木虱成蟲(本說明書實施例均以柑橘木虱成蟲為測試對象)浸沒于含0.1%吐溫-80的分生孢子懸浮液中1(T15 s，挑取處理后仍能自由活動的柑橘木虱置于培養皿中的九里香葉片上(培養皿底部鋪有2層用無菌水濕潤過的濾紙，其上放置一個帶10個左右葉片的九里香嫩枝，枝條底端以無菌水濕潤的脫脂棉包裹)，然后放于25°c光照培養箱中(每天14 h光照/10 h黑暗，濕度95%以上)培養，同時設立含0.1%吐溫-80的無菌水處理柑橘木虱為對照，培養7 d后觀察病菌對柑橘木虱的侵染和致死情況。之后再按步驟I中的方法從處理后的柑橘木虱蟲體中分離病菌，比較再分尚的病菌與初始接種的病菌的形態特征和培養特征。
[0028]通過以上操作，篩選出符合科赫氏法則的對柑橘木虱具致病性的菌株，排除從柑橘木虱蟲體上分離到的腐生菌等非致病菌。通過篩選，獲得I株對柑橘木虱具有致病力的菌株，將其命名ZJLSP07。
[0029]3、菌株的復壯:制備上述篩選到的對柑橘木虱具致病力的菌株ZJLSP07的分生孢子懸浮液，接種到健康柑橘木虱蟲體上，然后再從發病的柑橘木虱蟲體上分離純化病菌，具體操作方法同上。最后獲得分離純化的菌株ZJLSP07。
[0030]實施例2:菌株ZJLSP07的鑒定
1、菌株ZJLSP07的形態特征:將上述分離純化的菌株ZJLSP07接種到PDA培養基平板中央，置于25°C恒溫培養，每天觀察菌落生長情況并記錄菌落顏色和形態。將菌株ZJLSP07接種到另一 PDA培養基平板中央，同時將滅菌后的蓋玻片(I cmXl cm)斜插入距接種點約I cm左右處的培養基內，置于25 1:恒溫培養7 d左右待菌絲爬到蓋玻片上后，取出蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察菌株ZJLSP07的菌絲和孢子形態。
[0031]圖1是菌株ZJLSP07在PDA培養基上25 1:恒溫培養7 d后的形態特征，可見菌株ZJLSP07菌落呈圓形，菌落正面為白色絲絨狀，菌落背面呈淺黃色，具放射狀皺褶，無滲出液和色素產生。在光學顯微鏡下觀察菌株ZJLSP07的形態特征如圖2所示，可見其菌絲透明，有分隔，寬為1.2-2.2 μ m;瓶梗著生于匍匐狀氣生菌絲上，單生或對生，少數為輪生，瓶梗從基部向頂端逐漸變細，直立，大小為12.5-28X0.5-1.9 um ;分生孢子單生于瓶梗頂端，壁光滑，大小不一，呈橢圓形、紡錘形或鐮刀形，其中大分生孢子大小為
5.5-8.5X1.5-2.5 μ m，小分生孢子大小為3.0-4.5X 1.0-2.0 μπι;未見厚垣孢子。參考相關文獻(Zare R, et al.A revision of Verticillium sect.Prostrata.1I1.Generic classification.Nova Hedwigia.2001， 72:329-337; Zare R， et al.Arevision of Verticillium section Prostrata.1V.The genera Lecanicillium andSimpliciIlium gen nov.Nova Hedwigia, 2001，73:1 - 50; Kope H H，et al.A newspecies of Lecanicillium isolated from the white pine weevil, Pissodesstrobi.Mycotaxonj 2005， 94:331 - 340; Zare R，et al.A revision of the Verticilliumfungi cola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium.Mycological Research, 2008，112:811-824; Sukarno H et al.LecaniciIlium andVerticillium species from Indonesia and Japan including three new species.Mycosciencej 2009， 50:369—379; Kaifuchi S， et al.Lecanicillium primulinum, anew hyphomycete (Cordycipitaceae) from soils in the Okinawa’s main island andthe Bonin Islands, Japan.Mycosciencej 2013，54:291-296.)關于錯階菌屬及屬內各種的描述，結合菌株ZJLSP07的形態學特征和侵染柑橘木虱的特性，明確菌株ZJLSP07具備蠟蚧菌屬真菌的典型特征，因此將其鑒定為肉座菌目蟲草菌科蠟蚧菌屬的真菌，但其與該屬已知菌種的形態特征又存在差別。[0032]2、菌株ZJLSP07的序列分析:將菌株ZJLSP07接種至PDA培養基平板，置于25 °C恒溫培養10 d左右，以無菌藥匙刮取PDA平板上生長的真菌菌絲于無菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，采用改良的CTAB法提取菌株ZJLSP07的總DNA。以純化的DNA為模板，用真菌通用引物NSl (5 ' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ')和NS2(5 ' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3 ')擴增菌株 ZJLSP07 的 18S rDNA,利用真菌通用弓丨物ITS5 (5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴增菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA_ITS2，利用真菌通用引物Bt2a(5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3')和 Bt2b(5' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')擴±曾菌株ZJLSP07 的 β-tubulin基因。PCR反應體系為:10XBuffer 2.5 yL,dNTPs 2 μ L,上下游引物(10 ymol/L>^1.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.2 yL，DNA模板I yL，無菌水補足至總體積 25 μ L。反應條件為:94°C 5 min ；94°C I min,55°C I min,72°C I min，35 個循環；最后72°C延伸10 min JCTAB法提取DNA等具體操作方法參考:鹿連明等.柑橘黃龍病菌核糖體蛋白基因的多態性及系統發育分析.浙江大學學報，2011，37(2): 125-132)。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收目的條帶后送交公司測序。將所測得序列整理后，利用NCBI Blast在線工具進行比對，分析其與與GenBank中菌種的對應序列的相似性；選取GenBank中登錄的蠟蚧菌屬各菌種的模式菌株或代表菌株的序列，利用EMBOSS Needle在線工具將其與菌株ZJLSP07的序列進行比對，分析其相似性；選取GenBank中登錄的臘階菌屬及先前分類為KeriiciWiw?屬的各菌種的模式菌株或代表菌株的ITS1-5.8S rDNA-1TS2序列，與菌株ZJLSP07的相應序列，利用Clustal X進行多重比對后，使用MEGA5.05軟件，通過Neighbor joining方法構建系統發育樹，在構建系統發育樹時進行自舉檢驗,重復抽樣的次數為1000。 [0033]測序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如SEQ ID NO:1所示，ITS1-5.8SrDNA-1TS2完整序列如SEQ ID NO:2所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID N0:3所示。利用NCBI Blast進行比對分析發現，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列與GenBank中多個不同菌種對應序列的相似性達99%~100% ;與其ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性較高的真菌為含蠟蚧菌屬在內的肉座菌目真菌，其中相似性最高的3個菌株為肉座菌目真菌，但作者只將其歸類到目或科，未對其進一步分類到屬和種，且相關文獻中也未有關于該菌株的形態描述。在覆蓋率100%的條件下，菌株ZJLSP07與GenBank中已確定種名的真菌的ITS1-5.8S rDNA-1TS2序列相似性最高僅為94% ;而其β -tubulin基因的部分DNA序列與GenBank中菌種對應序列的相似性最高僅為87%，該基因的編碼區序列(⑶S)與GenBank中菌種的相應序列的相似性最高為95%。利用EMBOSS Needle在線工具對菌株ZJLSP07的基因序列與蠟蚧菌屬各菌種的對應序列進行比對，結果詳見表1和表2，可見菌株Z幾SP07與蠟蚧菌屬各菌種的18S rDNA序列具有較高的相似性；而其ITS1-5.8S rDNA_ITS2完整序列與蠟蚧菌屬真菌的對應序列相似性最高僅為93.9% ;其β -tubulin基因的DNA序列(含內含子)與GenBank中已登錄的蠟蚧菌屬真菌的相似性最高僅為84.0%，其編碼區序列的相似性最高僅為93.8%。在基于ITS1-5.8S rDNA_ITS2構建的系統發育樹中(如圖3)，菌株ZJLSP07與該屬的所有菌種聚為一個分支，支持菌株ZJLSP07為蠟蚧菌屬真菌的結論，在置信度95%下，菌株ZJLSPO 7與其親緣關系最近的Lecanici 11 iumkal imantanense和LecaniciIliumwallacei又分處于兩個不同的小的分支中，表明菌株ZJLSP07又有別于臘蚧菌屬已知菌種。
[0034].表1菌銖ZJLSKT與--|重屬已知科的I &S.DNA和ITSl^SS ,DKA4TS2 ?序？姻瞧.;.職.K
【權利要求】
1.一種對柑橘木虱具致病力的蠟蚧菌屬真菌新種，其特征在于該真菌菌株為蠟蚧菌Uecanicillliuni sp.)ZJLSP07，已于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.7803。
2.如權利要求1所述的蠟蚧菌屬真菌新種，其特征在于制備用于防治柑橘木虱的生物藥劑。
【文檔編號】C12R1/645GK103468579SQ201310341306
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】鹿連明, 陳國慶, 杜丹超, 蒲占湑, 胡秀榮 申請人:浙江省柑桔研究所