專利名稱：一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝的制作方法
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供了一種朽1檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
檸檬酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸，分子式C6H8O7 (無水物)，是一種廣泛地應(yīng)用于食品，醫(yī)藥和化工領(lǐng)域的有機酸。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，各行各業(yè)對檸檬酸的需求量將穩(wěn)步上升，當(dāng)然各企業(yè)面對的挑戰(zhàn)與機遇也越來越多。
目前，檸檬酸生產(chǎn)主要有連續(xù)發(fā)酵和分批發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程，由于檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)為好氧發(fā)酵，因此在連續(xù)培養(yǎng)過程中難以保證料液的先進先出性，從而降低營養(yǎng)的利用率；同時造成部分處于產(chǎn)酸旺盛期的黑曲霉菌種流失，而且連續(xù)發(fā)酵容易染菌，染菌后同時處理多個發(fā)酵罐非常麻煩。分批發(fā)酵是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的發(fā)酵過程，但是，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵體系中總糖濃度逐漸降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵系數(shù)低、周期長，能耗高、成本高，設(shè)備利用率低等。發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供了一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝一補料分批發(fā)酵，是在微生物分批發(fā)酵過程中，向發(fā)酵系統(tǒng)中補加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)，采用本發(fā)明提高了菌種的利用率，糖酸轉(zhuǎn)化率， 設(shè)備利用率，縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明主要是在檸檬酸發(fā)酵過程中，向發(fā)酵罐中補加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%-15%。其具體步驟為
(I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加氮源，消毒后接入生產(chǎn)菌孢子，進行種子液培養(yǎng)；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿打入發(fā)酵罐中，制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并向其中加入酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖和含氮量， 制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，待發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
首先，將玉米液化液打入種子罐中，同時添加氮源，由于無機氮源可以被菌體快速吸收利用，而且價格相對便宜，所以本發(fā)明氮源采用無機氮源，例如硫酸銨。氮源的加入量為本領(lǐng)域的常規(guī)用量。添加氮源后按照本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)進行消毒，然后接入生產(chǎn)菌孢子`進行種子液培養(yǎng)，生產(chǎn)菌孢子可以采用黑曲霉Co-827等，其接入量一般為每毫升種子液中接入70-80萬個孢子。由于種子液種齡過大會降低接種后的產(chǎn)酸速率；種齡過小，導(dǎo)致接種后菌體生長期延長，從而延長整個發(fā)酵時間，所以本發(fā)明種子液種齡為28-30h。
制備發(fā)酵培養(yǎng)基時，以體積比計，過濾玉米液化液清液玉米液化液棉籽粉漿液豆柏粉漿=16 2 I 1，從而實現(xiàn)發(fā)酵液初始含氮量在110-120mg/100mL。發(fā)酵液初始含氮量過大會導(dǎo)致菌體生長過于旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，從而抑制發(fā)酵前期的產(chǎn)酸；過低又會導(dǎo)致菌體生長緩慢，甚至生長不良，降低產(chǎn)酸速率。另外，總糖過高則抑制菌體生長，總糖過低則菌體生長旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌體發(fā)酵前期產(chǎn)酸速率，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基初始總糖濃度為20. 00-21. 50g/100mL。該步驟中的棉籽粉漿液和豆柏粉漿還可以提供生長因子如氨基酸、維生素和生物素等。本發(fā)明中棉籽粉漿液和豆柏粉漿液的質(zhì)量分數(shù)控制在25%-30%之間。其質(zhì)量分數(shù)過低會導(dǎo)致提供的生長因子不足，產(chǎn)酸代謝異常，出現(xiàn)后期產(chǎn)酸速率下降，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液殘?zhí)歉撸D(zhuǎn)化率降低；質(zhì)量分數(shù)過高時， 既增加了生產(chǎn)成本，又導(dǎo)致后期菌體繼續(xù)生長，不利于產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率的提高。
為了提高后期發(fā)酵液中氨基酸、小分子肽類物質(zhì)的增加，有利于菌種快速的吸收利用氮源，加快菌種的生長與產(chǎn)酸，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入酸性蛋白酶用于促進蛋白質(zhì)的水解， 其添加量為每克干基添加10個酶單位的酸性蛋白酶。
為了提高菌種的利用率，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明在發(fā)酵過程中補加流加液。本發(fā)明所述的流加液的制備過程為將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合后，糖化，然后向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為35-40g/100mL，含氮量為 45-50mg/100mL，制得流加液。含氮量過大或過小都會降低流加后的菌體產(chǎn)酸速率，因此，為了避免影響黑曲霉菌體的正常代謝，流加液的含氮量控制在45-50mg/100mL。流加液總糖濃度過低，則無法在理想程度范圍內(nèi)提高發(fā)酵產(chǎn)酸量，流加液總糖濃度過高，則使其粘稠度增加，增加制備難度，因此該過程中，糖蜜主要是用來提高流加液總糖濃度。由于糖蜜中含有灰分物質(zhì)與過量的Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+等金屬離子，不利于后期檸檬酸發(fā)酵，因此，在使用前需要采用黃血鹽、粗檸檬酸等進行過濾處理。流加液中的主要成分玉米液化液和糖蜜，為后期發(fā)酵補充了氮源、碳源和生物素等營養(yǎng)物質(zhì)。
將制備好的種子液移入發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，本發(fā)明中加入的種子液的體積占總發(fā)酵液體積的11-13%，從而保證發(fā)酵液中菌球濃度達到38000-40000個/mL，使得發(fā)酵順利進行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中發(fā)酵可利用的總糖較現(xiàn)有技術(shù)提高了 10%以上，為了提高發(fā)酵指數(shù)，同時不降低轉(zhuǎn)化率，通過實驗證明發(fā)酵液中菌球數(shù)控制在38000-40000個/mL之間，即能保證較高的轉(zhuǎn)化率，又能提高發(fā)酵指數(shù)，在較短的時間內(nèi)結(jié)束發(fā)酵。低于38000個 /mL會降低發(fā)酵指數(shù)，高于40000個/mL會降低轉(zhuǎn)化率，同時也增加了成本。待發(fā)酵30_32h 后，菌體生長期已經(jīng)基本結(jié)束，且產(chǎn)酸速率出現(xiàn)下降趨勢，因此，需要向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液。補料過早，影響菌體生長，不利于產(chǎn)酸；補料過晚，菌體有衰亡趨勢，也無法提高產(chǎn)酸。 流加體積過大，容易導(dǎo)致流加前后黑曲霉菌體周圍生理環(huán)境變化過大，不利于黑曲霉菌體繼續(xù)產(chǎn)酸；流加體積過小，就需要提高流加液的總糖濃度，從而提高了流加液的制備難度， 因此，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%-15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果
1、本發(fā)明通過流加技術(shù)，在發(fā)酵過程中補加流加液，即同時補充碳源、氮源和生物素等營養(yǎng)物質(zhì)，既避免了高初糖濃度對檸檬酸發(fā)酵的抑制，又避免了發(fā)酵后期總糖濃度 過低，從而保證檸檬酸發(fā)酵持續(xù)高效進行，使發(fā)酵時間延長，提高菌種的利用率，延長了菌種的產(chǎn)酸時間，提高糖酸轉(zhuǎn)化率與設(shè)備利用率，從而降低發(fā)酵成本。
2、與連續(xù)發(fā)酵相比，充分保證了發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的利用，避免了菌種的流失以及染菌。
具體實施方式
實施例1
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其具體步驟為
( I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積O. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為 28h ；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿按16 :2:1:1 的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為21. 50g/100mL，然后降溫至37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為37g/100mL，含氮量為45mg/100mL，制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的 12%，發(fā)酵液中菌球濃度達到38000個/mL，通風(fēng)發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵55h，產(chǎn)酸19. 93%，轉(zhuǎn)化率101. 12%，發(fā)酵指數(shù)為3. 62g/L · h。
實施例2
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其具體步驟為
( I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積O. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為 29h ；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿按16 :2:1:1 的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為20. 50g/100mL，然后降溫至37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為35g/100mL，含氮量為50mg/100mL，制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的 種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的 13%，發(fā)酵液中菌球濃度達到38000個/mL，通風(fēng)發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵56h，產(chǎn)酸20. 65%，轉(zhuǎn)化率101. 82%，發(fā)酵指數(shù)為3. 69g/L · h。
實施例3
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其具體步驟為
( I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積O. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為 30h ；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿按16 :2:1:1 的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為20. 00g/100mL，然后降溫至37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為40g/100mL，含氮量為46mg/100mL，制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的 11%，發(fā)酵液中菌球濃度達到38000個/mL，通風(fēng)發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵57h，產(chǎn)酸21. 66%，轉(zhuǎn)化率102. 22%，發(fā)酵指數(shù)為3. 80g/L · h。
實施例4
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其具體步驟為
(I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積O. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為28.5h ；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿按16 :2:1:1 的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為21. 00g/100mL，然后降溫至37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為36g/100mL，含氮量為47mg/100mL，制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的11.5%，發(fā)酵液中菌球濃度達到38000個/mL，通風(fēng)發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵60h，產(chǎn)酸22. 32%，轉(zhuǎn)化率101. 55%，發(fā)酵指數(shù)為3. 72g/L · h。
實施例5
一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其具體步驟為
( I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積0. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為29.5h ；
(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿按16 :2:1:1 的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為21. 50g/100mL，然后降溫至37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按照體積比為6-10:1混合，糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖濃度為38g/100mL，含氮量為48mg/100mL，制得流加液；
(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，種子液體積占總發(fā)酵液體積的12.5%，發(fā)酵液中菌球濃度達到38000個/mL，通風(fēng)發(fā)酵30_32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%_15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵62h，產(chǎn)酸22. 62%，轉(zhuǎn)化率101. 75%，發(fā)酵指數(shù)為3. 65g/L · h。
比較例
目前的玉米粉分批發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸工藝， 其具體步驟為
(I)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加占培養(yǎng)基體積O. 025%的硫酸銨作為無機氮源，升溫至121°C消毒30分鐘，降溫至37°C后接入孢子進行種子液培養(yǎng)，種子液種齡為 28h ；
(2)將過濾玉米液化清液和玉米液化液按3 I的體積比打入發(fā)酵罐中，開啟攪拌使培養(yǎng)基混合均勻，升溫至90°C消毒30分鐘，初始總糖濃度為21. 00g/100mL，然后降溫至 37°C，加入每克干基10個酶單位的酸性蛋白酶；
(3)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，種子液體積占總發(fā)酵體積的11%，使發(fā)酵液中菌球濃度達到30000個/mL，并保證通風(fēng)，37 °C下發(fā)酵至發(fā)酵終了。
在此條件下，發(fā)酵54h，產(chǎn)酸18. 57%，轉(zhuǎn)化率100. 12%，發(fā)酵指數(shù)為3. 44g/L · h。
表I本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)指標對比
權(quán)利要求
1.一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于在檸檬酸發(fā)酵過程中，向發(fā)酵罐中補加流加液，流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%-15%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于其具體步驟為(1)將玉米液化液打入種子罐中，同時添加氮源，消毒后接入生產(chǎn)菌孢子，進行種子液培養(yǎng)；(2)將過濾玉米液化清液、玉米液化液、棉籽粉漿液和豆柏粉漿打入發(fā)酵罐中，制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并向其中加入酸性蛋白酶；(3)將過濾玉米液化清液和玉米液化液糖化，向其中添加糖蜜調(diào)整總糖和含氮量，制得流加液；(4)將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵罐中，開始發(fā)酵，待發(fā)酵30-32h后向發(fā)酵罐內(nèi)流加流加液,流加液體積加入量為額定發(fā)酵體積的10%-15%，流加完畢后再次發(fā)酵至發(fā)酵終了。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于步驟(I)所述種子液種齡為 28-30h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于以體積比計，步驟(2)中過濾玉米液化液清液玉米液化液棉籽粉漿液豆柏粉漿=16 2 I I;發(fā)酵培養(yǎng)基初始總糖濃度為 20. 00-21. 50g/100mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于添加量為每克干基添加10個酶單位的酸性蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于清液和玉米液化液的體積比為6-10:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于糖濃度為 35-40g/100mL，含氮量為 45_50mg/100mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于體積占總發(fā)酵液體積的11 -13 %。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于液中菌球濃度為38000-40000個/ml。:步驟(2)中酸性蛋白酶的 :步驟(3)中過濾玉米液化 :步驟(3)所述的流加液總 :步驟(4)中加入的種子液 :步驟(4)中發(fā)酵初期發(fā)酵
全文摘要
本發(fā)明提供一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特點是在檸檬酸發(fā)酵過程中，向發(fā)酵罐中補加流加液。本發(fā)明通過補料分批發(fā)酵時流加高糖濃度的流加液提高了發(fā)酵產(chǎn)酸濃度，又避免了高初糖濃度對檸檬酸發(fā)酵的抑制。采用本發(fā)明后，不僅能提高發(fā)酵產(chǎn)酸濃度，而且能加快發(fā)酵生產(chǎn)強度、提高發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率和設(shè)備利用率，進而提高了企業(yè)的經(jīng)濟效益，提升了企業(yè)的競爭力。
文檔編號C12P7/48GK103060393SQ20121057474
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者寇光智, 李昌濤, 王有旭, 周一江, 周昊, 秦緒斌 申請人:日照金禾博源生化有限公司