專利名稱：一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多孔細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法，特別是涉及一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法，具體地說是一種通過調節發酵培養液上方空氣氣壓以及氧氣濃 度來實現細菌纖維素薄膜的密疏雙層結構，并在培養過程中加入緩釋微球制得具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。
背景技術：
皮膚被覆蓋于人體全身表面，與外界環境直接接觸，是解剖學和生理學上的重要邊界器官。皮膚不僅能使人體不受到污染物或細菌的侵襲，也能保持人體水分不流失。由于皮膚對人體的重要保護作用，因此一旦皮膚發生大面積損傷或缺失時，便會對人體造成致命的傷害。皮膚不具備自修復的功能，為了修復、代替缺損的皮膚組織，各國的科學家都在致力于開發具有良好治療效果的人造皮膚。從結構上來說人體皮膚由表皮層和真皮層組成。表皮層在皮膚的最外層，表皮細胞彼此聯接緊密，主要起到抵抗外界刺激以及防御的功能，因此是皮膚結構中最致密的一層。真皮層主要由膠原纖維和彈性纖維組成，主要起到保持皮膚彈性和張力的作用。由于真皮層中還富含血管、淋巴管以及毛發、皮脂腺、汗腺和肌肉，因此真皮層相較于表皮層結構更為疏松。因此，從表皮層到真皮層，人體的皮膚在結構上是具備一定梯度性的。早期的人造皮膚主要有網狀編織類人造皮膚，聚氨酯人造皮膚以及有機硅膜人造皮膚。這些早期人造皮膚無梯度變化，為均一結構，因此應用于臨床治療時不利于細胞的附著生長，造成新生皮膚生長緩慢從而延長了傷口愈合時間和治療周期。具有梯度結構的人造皮膚從結構上來看更接近真實的皮膚，因此可以有效誘導缺損組織處細胞的遷移、增殖和分化。利用具有梯度結構的人造皮膚原位誘導缺損皮膚再生，可以大大的縮短傷口愈合周期。此外，還可以增強創面愈合后的皮膚彈性、柔韌性和機械耐磨性以及減少瘢痕增生。因此，在設計人造皮膚材料時，通常應模擬皮膚的表皮和真皮雙層結構的特點，設計具有模擬表皮層和真皮層的雙層結構人造皮膚。隨著組織工程技術的發展，組織工程皮膚已成為皮膚缺損治療的熱點，理想的組織工程皮膚能夠模擬天然皮膚的雙層結構，具有三維多孔結構能夠提供細胞向材料內部粘附、增殖、分化的空間，同時多孔結構也是獲得營養和氧氣、排出代謝產物的通道以及血管化的場所。近幾年來，關于具有梯度結構的人造皮膚的研究已經取得了不少的成果。CN101716375公開了一種由純天然原料制備的具有梯度孔結構和性能的人工皮膚，這種人工皮膚由表皮層和真皮層構成，其中表皮層是由纖維蛋白或絲素蛋白等蛋白與殼聚糖等多糖構成的薄膜結構，真皮層的主要成分是膠原蛋白。CN 101716376A公開了一種生長因子緩釋型雙層人工皮膚，這種人工皮膚的表皮層是具有防水、透氣、保護功能的聚氨酯或硅橡膠或聚乙二醇微孔薄膜，真皮層是由絲素蛋白和殼聚糖構成的生物大分子薄膜。CN 102526810A公開了一種人工皮膚替代材料及制備方法，這種替代材料具有雙層結構，其中基層為聚氨酯材料，在基層表面覆蓋一層聚氨酯與聚N-異丙基丙烯酰胺經接枝共聚改性形成的結構層。這種替代物具有與真實皮膚相近的良好力學性能。CN 102526808A公開了一種人工皮膚及制備方法，該人工皮膚包括微孔膜狀表皮層以及天然高分子仿生真皮層。表皮層的主要成分為聚偏氟乙烯和/或其共聚物聚偏氟乙烯-三氟乙烯，真皮層是膠原膜。CN 1785444A公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架及其制備方法，該皮膚再生支架由膠原/殼聚糖多孔支架通過生物相容性良好的膠黏劑粘合而成。目前已經公開的具有雙層結構的人工皮膚制備技術主要通過涂膜、膠粘、噴淋成膜、熱壓成膜等復合方式人為地將人造表皮層與人造真皮層結合。其中涂膜與噴淋成膜是將表皮膠液噴涂到成型的人造真皮層表面，形成表面化學鍵合后得到人造皮膚；膠粘與熱壓成膜是指利用粘合劑通過分子間氫鍵與范德華力將已經成型的表皮層與真皮層結合。現有技術的人造皮膚在表皮層與真皮層結合界面存在結構上的突變，在各層內部不存在結構的梯度變化，只是簡單的上密下疏結構。這樣的構造不僅使皮膚組織細胞在材料疏密層結合界面處生長緩慢，還會破壞新生皮膚真皮層與表皮層結構的連續性，從而延長了治療周期并且會使傷口處形成明顯的疤痕。此外，膠粘與涂膜的制備工藝會在較大程度上影響表 皮層與真皮層之間連通性最終影響人造皮膚材料的透氣性能。現有技術中涉及的人造皮膚真皮層材料通常選用生物相容性良好的膠原蛋白，絲束蛋白，表皮層材料通常選用可降解材料(聚乳酸，聚乙二醇)或者惰性材料(硅橡膠，聚偏氟乙烯，聚氨酯)，使其制備成本十分高昂，同時表皮層與真皮層由兩種不同材料構成也增加了人為復合保證兩種材料結合緊密的難度。細菌纖維素(Bacterial Cellulose,也稱微生物纖維素)，是世界上公認的性能優異的新型生物材料。細菌纖維素的物理、化學和機械性能具有許多獨特的性質超細網狀結構；高抗張強度和彈性模量；具有較高親水性的同時，兼具良好的透氣、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高濕強度。大量研究表明細菌纖維素具有良好的體內、體外生物相容性和良好的生物可降解性，極好的形狀維持性能和形狀可調控性。因此采用細菌纖維素作為皮膚修復材料具有以往其它生物材料、織物等無可比擬的優點，它是一種較理想的皮膚修復材料。

發明內容
本發明專利通過控制BC的培養條件并在培養過程中加入緩釋微球，能夠快速簡便地制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”的生物結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。與現有技術中多層狀復合相比，本發明是使用細菌纖維素作為皮膚修復材料的基材。細菌纖維素具有良好的生物相容性以及細胞活性，是一種應用廣泛的組織工程支架材料。本發明通過控制細菌纖維素培養過程中的培養條件，使β -I, 4-葡萄糖鏈構成的纖維素微纖絲在通過分子內與分子間氫鍵結合并結晶成型的過程中，自發、有序地形成疏松到致密漸變的結構。結合程度更深，不僅局限于材料表面。與現有技術人為構造表皮層與真皮層相t匕，本發明制備得到的具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料無明顯物理分層，結構連續性十分良好，不存在現有技術人造皮膚產品在兩層界面處結構不連續的缺點；其次，疏松層與致密層內也存在結構的梯度變化，使得材料在最大程度上模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構，能夠明顯縮短傷口愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生；此外，均勻的多孔結構能夠加快血管化也可以作為組織工程皮膚的支架材料應用于皮膚修復。由于成型過程連續，本發明制備得到的具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料保持了細菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長時間地使病患的創面維持一個濕態的環境，更有利于創面的愈合。具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉，是一種理想的皮膚修復材料。本發明的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過β -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本單元并非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行，通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為I. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，β -I, 4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述致密層中的纖維素含量O. 7Χ 10_2 I. OX 10_2g/cm3 ;所述疏松層中的纖維素含量O. 2 X IO-2 O. 5X l(T2g/cm3，所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。作為優選的技術方案如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，所述的細菌纖維素膜是由菌種在靜置培養條件下，消耗糖源，與細胞內合成β -I, 4-葡萄糖鏈并擠出細胞體外。3 4條β-1，4-葡萄糖鏈通過分子內與分子間氫鍵作用形成脂多糖層，4 5個脂多糖層通過分子內與分子間氫鍵形成直徑在I. 5nm左右的類晶團聚體，3 5個類晶團聚體通過分子內與分子間氫鍵形成直徑在3. 5nm左右的纖維素微纖絲，多條微纖絲通過分子內與分子間氫鍵作用形成纖維素絲束，多條絲束通過分子內與分子間氫鍵作用形成纖維素絲帶。菌種細胞在發酵培養液表面無序運動，即使細胞發生分裂也不會影響纖維素絲帶發生斷裂。由β_1，4-葡萄糖鏈通過分子內與分子間氫鍵形成的纖維素微纖絲相互交織，彼此通過分子內與分子間氫鍵相互作用，最終在液面形成類似與無紡布結構的細菌纖維素膜。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，所述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 15mm,其中所述疏松層的厚度為6 13mm。本發明還提供了一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，包括以下步驟I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05 O. 5，酵母膏O. 05 O. 5，檸檬酸O. 01 O. 1，磷酸氫二鈉O. 02 O. 2，磷酸二氫鉀O. 01 O. I ;發酵培養液的pH為4. O 6. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；
2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X IO5 2X IO7 個/ml。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 32 °C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構。通過在疏松層靜置培養過程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過分子內與分子間氫鍵結合，結晶形成細菌纖維素的過程中，原位包覆緩釋微球，微 球降解后，形成疏松層內部多孔結構；a.細菌纖維素生長誘導期I 2天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2 3天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10 15% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 3mm O. 5mm ;c.細菌纖維素平穩生長期3 4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I I. 5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50 100%范圍內；直至細菌纖維素膜厚度達到I 4mm ；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；需要指出的是平穩期生長階段中，先培養疏松層，再培養致密層也能得到相同結構的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。如上所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的緩釋微球為具有皮芯結構，外徑為50 250 μ m ;其中，緩釋微球內部含有過氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；緩釋微球囊壁材料為明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原。所述的均勻加入是指將緩釋微球均勻分散在經過滅菌處理，調配好的發酵培養液中，速率在I 10mL/min范圍內，由細菌纖維素薄膜上方噴淋至細菌纖維素薄膜上表面，液滴直徑范圍在50 250 μ m,其中80%的液滴直徑小于150 μ m,噴淋時間在5 10分鐘范圍內。所述的緩釋微球均勻加入至細菌纖維素薄膜上表面后，在24 72小時內持續釋放緩釋微球內部物質，并在內部物質釋放完畢后的48小時內，緩釋微球囊壁以溶解或降解的方式消失。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的高壓蒸汽滅菌后紫外輻照是指將所述發酵培養液置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的發酵培養液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種后的發酵培養液于28 32°C下搖床培養8 24小時。 如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的加壓為連續增壓或階段性增壓。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的連續增壓是指每分鐘向容器內充入壓力百分數為I. 32 X 10_2 5. 63 X 10_2%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. I I. 5個標準大氣壓時不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時向容器內充入壓力百分數為O. 797 3. 437%的空氣，基數同樣是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. I I. 5個標準大氣壓時不再增加壓力。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的提高氧氣濃度為連續增加或階段性增加；所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 05 O. 06%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；所述的階段性增加是指在上述連續增壓或階段性增壓過程中，使氧氣濃度每小時增加2. 92 3. 33%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料置于4°C下保存。本發明的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，所述具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料與細胞生長因子、活性多肽以及抗菌物質通過物理吸附的方式進行復合；分別配置濃度為5 10wt%的細胞生長因子、活性多肽、抗菌物質的溶液，將材料在27 35°C的條件下分別在上述溶液中浸泡5 10天，隨后經過清洗、滅菌，即可得到復合了細胞生長因子、活性多肽以及抗菌物質的皮膚修復材料。細菌纖維素作為一種新型的天然水凝膠具有其獨特的物理、化學和機械性質超細網狀結構；高抗張強度和彈性模量；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高濕強度。細菌纖維素的微纖絲束直徑為3 4nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70 80nm,長度為I 9 μ m,是目前最細的天然纖維。大量研究表明細菌纖維素具有良好的體內、體外生物相容性。極好的形狀維持性能和原位成型性。可以任意裁剪與皮膚有極好的伏貼性；獨特的三維網狀結構使得其能夠在很長一段時間里保持濕潤的狀態，濕潤的環境易于組織再生、還可以有效地減輕患者的疼痛，特殊的納米結構促進細胞的相互作用、促進組織再生及減少疤痕組織生成；同時，還有利于材料在傷口處安全、方便地釋放負載的藥物，進一步促進傷口愈合。本發明的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其納米三維網狀結構為細胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學支持，起到模擬細胞外基質(Extracellularmatrix,ECM)的作用。多孔結構的微孔能夠提供細胞向材料內部粘附、增殖、分化的空間，同時多孔結構也是獲得營養和氧氣、排出代謝產物的通道以及血管化的場所。具有良好的組織相容性；生物可降解性和適合的降解率。本專利發明的一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料能夠作為敷料產品根據患者病情的實際情況培養得到與患者傷口皮膚相似上密下疏的生物結構，可以在很大程度上縮短患者傷口愈合的周期，并且明顯減少愈合后疤痕的產生。同時，也可以作為組織工程支架材料應用于皮膚修復領域。
有益效果與現有技術先比，本發明的有益效果是(I) 一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料成型過程連續，疏松層與致密層之間由納米微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合。使β_1，4-葡萄糖鏈構成的纖維素微纖絲在通過分子內與分子間氫鍵結合并結晶成型的過程中，自發、有序地形成疏松到致密漸變的結構。結合程度更深，不僅局限于材料表面。(2) 一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料無明顯物理分層，結構連續性十分良好，不存在現有技術人造皮膚產品在兩層界面處結構不連續的缺點；其次，制備過程中加入緩釋微球制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。疏松層與致密層內存在結構的梯度變化，疏松層中具有均勻分布的多孔，最大程度模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構。(3) 一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料在現有技術基礎上，通過增加培養過程中與細菌纖維素薄膜相接觸的空氣壓力，使得細菌纖維素薄膜內部有氧區面積增加；同時精確控制壓力，不使細菌纖維素薄膜下沉。改善了現有技術中只依靠提高氧氣分壓來構造疏密結構的單一工藝，同時也解決了氧氣分壓過高所導致纖維素增長速度變緩的缺陷。(4) 一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料保持了細菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長時間地使病患的創面維持一個濕態的環境，更有利于創面的愈合。能夠明顯縮短傷口愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生。(5) 一種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料(6) —種具有疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉，是一種理想的皮膚修復材料。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發明的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過β -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本單元并非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行，通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為I. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，β -I, 4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述致密層中的纖維素含量O. 7Χ 10_2 I. OX 10_2g/cm3，所述疏松層中的纖 維素含量O. 2 X Kr2 O. 5X l(T2g/cm3。所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。所述的細菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合形成。所述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 15mm，其中所述疏松層的厚度為6 13mm。低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例II)發酵培養液的調配；培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨
O.05，酵母膏O. 05，檸檬酸O. 01，磷酸氫二鈉O. 02，磷酸二氫鉀O. 01 ；培養液的pH為4. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X105個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構。通過在疏松層靜置培養過程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過分子內與分子間氫鍵結合，結晶形成細菌纖維素的過程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內部多孔結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 3 O. 5mm ;
c.細菌纖維素平穩生長期3天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50% ;直至細菌纖維素膜厚度達到I 4mm ;疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；
、
靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例2I)發酵培養液的調配；培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨
O.5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；培養液的pH為6. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，32 °C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構。通過在疏松層靜置培養過程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過分子內與分子間氫鍵結合，結晶形成細菌纖維素的過程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內部多孔結構；a.細菌纖維素生長誘導期2天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期3天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在15% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 3 O. 5mm ;c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至100% ;直至細菌纖維素膜厚度達到I 4mm ;
疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為15%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持10小時，用純凈水清洗至pH為7. O,材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例3
I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨O. 3，酵母膏O. 3，檸檬酸O. 05，磷酸氫二鈉O. I，磷酸二氫鉀O. 05 ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構。通過在疏松層靜置培養過程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過分子內與分子間氫鍵結合，結晶形成細菌纖維素的過程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內部多孔結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在12. 5% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 3 O. 5mm ;c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至75% ;直至細菌纖維素膜厚度達到I 4mm ;疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I. 3個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為12. 5%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為12. 5%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例4I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ； 發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用連續增壓，每分鐘向容器內充入壓力百分數I. 32X10_2%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為1.1個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 05%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例5I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用連續增壓，每分鐘向容器內充入壓力百分數5. 63X10_2%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. 5個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 06%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。
實施例6I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；
2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數O. 797%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為1.1個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時增加2. 92%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例7I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接 和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數3. 437%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. 5個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 5個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時增加3. 33%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例8I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個 標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用連續增壓，每分鐘向容器內充入壓力百分數3. OOX 10_2%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. 3個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 55%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例9I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。
3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ； c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數I. 50%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. 3個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. 3個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時增加3. 00%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。實施例10I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O. I，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O. I ；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；
通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天平穩生長期分兩個階段疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄 膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，即得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜；致密層形成階段，采用連續增壓，每分鐘向容器內充入壓力百分數I. 32X10_2%的空氣，基數是一個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. I個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 05%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7. O，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。
權利要求
1.一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其特征是具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過P -I, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層； 其中所述致密層中的纖維素含量0. 7X 10_2 I. OX 10_2g/cm3 ;所述疏松層中的纖維素含量0. 2 X Kr2 0. 5X l(T2g/cm3，所述疏松層中均勻分布有孔徑為50 250mm的微孔，孔隙率在80%以上。
2.根據權利要求I所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其特征在于，所述的細菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合形成；所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3.根據權利要求I所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其特征在于，所述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 15mm，其中所述疏松層的厚度為6 13mm。
4.如權利要求I所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征是包括以下步驟 1)發酵培養液的調配； 發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05 0. 5，酵母膏0. 05 0. 5，檸檬酸0. 01 0. 1，磷酸氫二鈉0. 02 0. 2，磷酸二氫鉀0. 01 0. I,余量為水； 發酵培養液的pH為4. 0 6. 0 ; 將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液； 2)菌種擴培； 將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2 X IO5 2 X IO7個/ml ; 3)靜置培養； 將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 .32 °C靜置培養； 通過分步調節發酵培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的疏密雙層結構；通過在疏松層靜置培養過程中添加緩釋微球，使纖維素微纖絲之間通過分子內與分子間氫鍵結合，結晶形成細菌纖維素的過程中，原位包覆緩釋微球，微球降解后，形成疏松層內部多孔結構； a.細菌纖維素生長誘導期I 2天控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將發酵培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜； b.細菌纖維素快速生長期2 3天控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣體積濃度在10 15%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到0. 3 ,0.5mm ； c.細菌纖維素平穩生長期3 4天 平穩生長期分兩個階段 致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在I. I I. 5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50 100%范圍內；直至細菌纖維素膜厚度達到I 4mm ； 疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至2 8mm時，在細菌纖維素薄膜上表面均勻加入緩釋微球；維持與細菌纖維素膜上表面接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素膜厚度達到8 15mm時將其取出，SP得到具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜； 4)后處理； 靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純凈水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。
5.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的緩釋微球為具有皮芯結構，外徑為50 250 ii m ;其中，緩釋微球內部含有過氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；緩釋微球囊壁材料為明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原；所述的均勻加入是指將緩釋微球均勻分散在經過滅菌處理，調配好的發酵培養液中，速率在I lOmL/min范圍內，由細菌纖維素薄膜上方噴淋至細菌纖維素薄膜上表面，液滴直徑范圍在50 250 ii m，其中80%的液滴直徑小于150 V- m,噴淋時間在5 10分鐘范圍內；所述的緩釋微球均勻加入至細菌纖維素薄膜上表面后，在24 72小時內持續釋放緩釋微球內部物質，并在內部物質釋放完畢后的48小時內，緩釋微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
6.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓蒸汽滅菌后紫外輻照是指將所述發酵培養液置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。
7.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的發酵培養液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種后的發酵培養液于28 32°C下搖床培養8 24小時。
8.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的加壓為連續增壓或階段性增壓；所述的連續增壓是指每分鐘向容器內充入壓力百分數為I. 32X10_2 5. 63X10_2%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為I. I I. 5個標準大氣壓時不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時向容器內充入壓力百分數為0. 797 3. 437%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為L I L 5個標準大氣壓時不再增加壓力。
9.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的提高氧氣濃度為連續增加或階段性增加；所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加0. 05 0. 06%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；所述的階段性增加是指在上述連續增壓或階段性增壓過程中，使氧氣濃度每小時增加2. 92 3. 33%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加。
10.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結構的多孔細菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料置于4°C下保存。
全文摘要
本發明涉及一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法。通過控制細菌纖維素的培養條件并在培養過程中加入緩釋微球制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料。疏松層與致密層結合緊密，無明顯物理分層，結構連續性好；疏松層與致密層內存在結構的梯度變化，疏松層中具有均勻分布的多孔，最大程度模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構。有利于細胞進入材料內部，明顯縮短傷口愈合周期并有效減少愈合后瘢痕的增生；同時保持了細菌纖維素良好的透氣性與持水性，能夠使創面維持濕態的環境，更利于創面的愈合。成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉。
文檔編號C12P19/04GK102973985SQ20121057550
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者李喆, 楊敬軒, 王利群, 鄭羿, 張云, 王華平, 陳仕艷 申請人:東華大學