一種優化的獲得無選擇標記轉基因生物的雙t-dna表達載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種優化的獲得無選擇標記轉基因生物的雙T-DNA表達載體及其應用。本發明提供的雙T-DNA載體A，為將雙T-DNA區域插入表達載體中上得到的載體；所述雙T-DNA區域包括兩個獨立T-DNA區域：T-DNA區域A和T-DNA區域B；所述T-DNA區域A的右邊界A和所述T-DNA區域B的右邊界相鄰，且所述T-DNA區域A的左邊界A和所述T-DNA區域B的左邊界相離。本發明的實驗證明，本發明構建的雙T-DNA質粒兩個T-DNA區的右邊界在質粒環中相互靠近，形成頭對頭的結構（LB-RB-RB-LR型），以期避免在轉錄的時候形成通讀，降低轉化基因與選擇標記基因的連鎖比例，從而提高T1代分離出無選擇標記轉基因株系幾率，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種優化的獲得無選擇標記轉基因生物的雙T-DNA表達載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種優化的獲得無選擇標記轉基因生物的雙T-DNA表達載體及其應用。
【背景技術】
[0002]植物轉基因技術自1983年問世以來，得到了長足的發展，它可以打破不同物種之間生物隔離，使物種之間的基因交流成為可能，讓轉基因作物向需要的方向發展。目前研究人員已發現多種不同的轉基因方法，如農桿菌介導法、基因槍法、PEG法、電激法、顯微注射法、脂質體法等(Sawahel W A, et al.1992.Biotech Advances.10:393-412)。利用這些轉化方法將外源目的基因導入到植物細胞時，通常只有部分細胞可以成為穩定的轉化細胞，選擇標記基因的應用使轉化細胞在相應的選擇壓力下仍可繼續存活并分化成植株，而非轉化細胞將死亡(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88:10558-10562)。然而，選擇標記基因及其蛋白產物畢竟不是基因工程的目的產品，從而引發有關轉基因植物安全的許多問題。主要有以下幾點:一是抗生素類基因編碼產物可能對人類或動物有潛在的毒性或致敏性；二是標記基因有可能會通過不同的途徑在物種間傳播，威脅生態環境，包括轉基因作物導致雜草問題、產生病毒或加重病害對非目標生物的影響。此外，選擇標記基因的存在還限制了轉基因作物的進一步改良，當轉基因植物中已存在某一選擇標記基因時，該基因在隨后的再次轉化中就不能再作為選擇標記，這樣便給植物再次導入外源基因帶來一定的限制。而由于目前可供利用的選擇標記基因為數甚少，不可能每次轉化都更換新的選擇標記基因，重復轉化將難以實現。因此，建立無選擇標記植物轉化系統，培育無選擇標記的轉基因植物將從根本上解決這個問題(Dekeyser R, et al.1989.PlantPhysiol.90:217-223)，且無論是從安全性考慮，還是從轉基因技術本身考慮均具有著重要的意義。
[0003]無選擇標記轉基因植物的研究和培育已成為國際上植物基因工程領域的一個趨勢。迄今，已有一些方法可獲得不帶選擇標記基因的轉化植物，主要的有轉座子成份介導法，位點特異性重組系統介導法及共轉化方法等(Yoder J I, et al.1994.Bio/Technology, 12:263-267)。目前有人對傳統的T-DNA共轉化方法做了功能改進，發明了一種獲得無選擇標記轉基因植物的專用載體，Chen等(Songbiao Chen, et al.2004.PlantCell Rep, 23:625-631)利用上述載體構建了含有⑶S基因的植物表達載體p⑶TGNGUS，通過農桿菌介導法轉化煙草。Ttl代共轉化頻率為53.6%，對共轉化T1代轉基因株系的遺傳分析表明，41.4%的株系發生基因分離，產生無選擇標記轉基因植株，但T1代18個株系中有6株系(33.3%)均成雙TDNA插入連鎖，影響了后代分離比。分析原因為該載體由于兩個T-DNA區相靠近，兩個T-DNA區的雙邊界為順勢(邊界型為LB-RB-LB-RB型)，可能在轉錄的時候形成通讀，導致兩個T-DNA連鎖插入同一位點，嚴重降低了后代分離標記基因。因此建立一種高效的獲得無選擇標記轉基 因植物培育體系具有重要的實際意義。
【發明內容】

[0004]本發明的一個目的是提供一種雙T-DNA載體A。
[0005]本發明提供的雙T-DNA載體A，包括雙T-DNA區域，所述雙T-DNA區域依次包括TDNA區域A和T-DNA區域B ;所述T-DNA區域A依次包括左邊界A、選擇標記基因表達盒和右邊界A ;所述T-DNA區域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的DNA的多克隆位點、第一個MAR和左邊界B ;所述T-DNA區域A的右邊界A和所述T-DNA區域B的右邊界B相鄰。
[0006]上述雙T-DNA載體A中，所述選擇標記基因和所述目的DNA的轉錄方向相反。
[0007]上述T-DNA區域A的左邊界A和所述T-DNA區域B的左邊界B相背離。
[0008]上述選擇標記基因表達盒包括啟動子、選擇標記基因和終止子。[0009]上述MAR(matrix attachment region, MAR)序列是一段核基質結合序列，置于外源表達結構的兩側可提高外源基因表達的水平，或明顯減少了外源基因在轉基因植株間的表達差異。利用MARs來穩定、提高外源基因的表達是克服外源基因失活的一種有效方法。
[0010]上述雙T-DNA載體A中，所述選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉移酶編碼基因、膦絲菌素乙酰轉移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述選擇標記基因具體為潮霉素磷酸轉移酶編碼基因或新霉素磷酸轉移酶基因；
[0011]所述用于插入目的DNA的多克隆位點依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoR10
[0012]上述雙T-DNA載體A為如下I)或2):
[0013]I)所述的雙T-DNA載體A (pDTmar-hyg)中的雙T-DNA區域依次包括所述左邊界A、終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因和啟動子35S、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點、所述第一個MAR和所述左邊界B ;1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域的核苷酸序列具體為序列表中的序列I ;
[0014]上述終止子CaMV35S polyA、潮霉素磷酸轉移酶編碼基因和啟動子35S構成選擇標記基因表達盒；
[0015]2)所述的雙T-DNA載體A (pDTmar-npt)中的雙T-DNA區域依次包括所述左邊界A、nos終止子、所述新霉素磷酸轉移酶基因和nos啟動子、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點、所述第一個MAR和所述左邊界B。2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域的核苷酸序列具體為序列表中的序列2。
[0016]上述nos終止子、所述新霉素磷酸轉移酶基因和nos啟動子構成選擇標記基因表達盒。
[0017]上述I)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將含有所述T-DNA區域B的片段插入含有所述T-DNA區域A的表達載體中，且使所述T-DNA區域A的右邊界A和所述T-DNA區域B的右邊界相鄰；所述含有所述T-DNA區域B片段的核苷酸序列具體為序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA區域A的表達載體具體為pC1300LaCZ_ ;具體為將序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ_載體的SphI酶切位點間得到的載體pDTmar-hyg ；
[0018]2)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒替換掉I)所述的雙T-DNA載體A中潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒得到的載體；所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒包括終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因和啟動子35S。具體為將新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒取代I)所述的雙TDNA載體A的Xhol/Pmel酶切識別位點間的小片段(潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒)得到的重組載體pDTmar-npt。
[0019]上述新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒按照如下方法獲得=EcoRI和ClaI (NEB)雙酶切質粒pCASmGFPt，收集2298bp的酶切產物，即得到新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒。
[0020]本發明的另一個目的是提供一種DNA片段。
[0021]本發明提供的DNA片段，為上述雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域。
[0022]本發明的第三個目的是提供一種雙T-DNA載體B。
[0023]本發明提供的雙T-DNA載體B，為將目的DNA插入上述的雙T-DNA載體A的用于插入目的DNA的多克隆位點得到的載體。
[0024]上述目的DNA以目的基因表達盒的形式插入；
[0025]所述目的基因表達盒具體為綠色熒光蛋白基因表達盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達盒；
[0026]所述綠色熒光蛋白基因表達盒進一步具體包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因mgfp5和nos終止子組成；所述綠色熒光蛋白基因表達盒的核苷酸序列進一步具體為序列表中的序列3 ；
[0027]所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達盒進一步具體包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos終止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達盒的核昔酸序列進一步具體為序列表中的序列4。
[0028]上述雙T-DNA 載體 B 具體為 pDTgfp-npt 和 pDTepsps-hyg ；
[0029]載體pDTgfp-npt為將序列表中序列3所示的綠色突光蛋白基因(mgfp5)表達盒插入pDTmar-npt載體的SmaI酶切位點間得到的載體。
[0030]載體PDT印sps-hyg為將序列表中序列4所示的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶基因表達盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位點間得到。
[0031 ] 上述的雙T-DNA載體A或上述的DNA片段或上述的雙T-DNA載體B在抑制雙T-DNA插入植物基因組發生連鎖中的應用也是本發明保護的范圍；上述應用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體煙草，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0032]上述的雙T-DNA載體A或上述的DNA片段或上述的雙T-DNA載體B在培育無選擇標記轉基因植物中的應用也是本發明保護的范圍；上述應用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體煙草，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0033] 選擇標記基因可以包括任何適用于遺傳轉化的選擇標記基因，例如新霉素憐酸轉移酶(neomycin phosphotransf erase-1 I, Npt-1I)基因、氣霉素乙酸轉移酶(chloramphenicol acetyl transferase, Cat)基因、二氫葉酸還原酶(Dihydrofolatereductase, DHFR)基因、潮霉素憐酸轉移酶(hygromycin phosphotransferase, Hpt)基因、勝絲菌素乙酸轉移酶(phosphinothricin-N-acetyltransferase, Bar)基因和5_烯醇丙酮莽草酸 _3_ 憐酸合酶(5-enolpyruvylshikimate_3-phosphatesynthase,EPSPs)基因等；目的基因可以包括任何在生產上有應用價值的基因，如抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因、抗衰老基因、抗逆基因、品質改良等基因以及由上述基因組成的融合或多價基因。所述目的基因的啟動子可以包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或者由啟動子和調控元件組成的復合啟動子。
[0034]上述植物包括雙子葉植物和單子葉植物，如煙草、棉花、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜，以及水稻、小麥、玉米、高梁、大麥、燕麥或黑麥等。當所述植物為煙草時，所述優化的雙T-DNA植物表達載體為pDTmar-npt。當所述植物為水稻時，所述優化的雙T-DNA植物表達載體為pDTmar-hyg。
[0035]定義
[0036]“植物表達載體”是指能驅動目的基因在植物體內表達的載體。
[0037]“Ti質?！笔歉┺r桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一種雙鏈環狀DNA 分子，一般具有 T-DNA 區(transferred-DNA regions)、毒性區(virulence region)、質粒復制起點(origin of replication)和質粒結合轉移位點(regions encodingconjugation)。在農桿菌侵染植物細胞時，T-DNA區在毒性區的激活下能從Ti質粒上轉移并整合到植物染色體中。Ti質粒載體系統目前被廣泛應用于植物基因工程領域。
[0038]“T-DNA”是根癌農桿菌內Ti質粒上的一段能從質粒上轉移并整合到寄主植物基因組中的DNA,即transferred DNA。T-DNA兩端各有一段長約25bp的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(LB)和右邊界(RB)。邊界序列的存在是T-DNA保留轉移特性的必需元件。當保留T-DNA的邊界序列時，以目的基因取代野生型T-DNA的部分基因組后，改造后的T-DNA仍能進入植物細胞并整合到植物染色體組中。T-DNA在受體植物染色體上的整合位點是隨機的。目前，在植物基因工程應用中，野生型根癌農桿菌T-DNA中的致瘤基因被外源目的基因和選擇標記基因替換，僅保留邊界序列。
[0039]“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區前面(5’非編碼區)和后面(3’非編碼區)的調控序列。
[0040]“外源基因”是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉移導入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導致一種內源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現。
[0041 ] 本發明的實驗證明，本發明在前期工作的基礎上，創造性的改變了雙T-DNA在表達載體中的排列方向，使構建的雙T-DNA質粒兩個T-DNA區的右邊界在質粒環中相互靠近，形成頭對頭的結構(LB-RB-RB-LR型)，以期避免在轉錄的時候形成通讀，降低轉化基因與選擇標記基因的連鎖比例，從而提高T1代分離出無選擇標記轉基因株系幾率，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為中間載 體pC1300LacZ-的物理圖譜
[0043]圖2為中間載體pCDMAR-hyg的物理圖譜[0044]圖3為優化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_hyg的物理圖譜
[0045]圖4為優化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_hyg的雙T-DNA區域的線性結構
[0046]圖5為中間載體pCASmGFPt的物理圖譜
[0047]圖6為優化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_npt的物理圖譜
[0048]圖7為優化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_npt的雙T-DNA區域的線性結構
[0049]圖8為中間載體pSPmGFP5的物理圖譜
[0050]圖9為整合目的基因gfp的優化后的雙T-DNA表達載體pDTgfp-npt的物理圖譜 [0051]圖10為整合基因epsps的未優化載體pQ)epsps_hyg的物理圖譜
[0052]圖11為整合基因epsps的優化后載體pDTepsps_hyg的物理圖譜
[0053]圖12為整合目的基因gfp的未優化的雙T-DNA表達載體pCDgfp-npt的物理圖譜
[0054]圖13為轉整合gfp基因的優化及未優化載體Ttl代煙草植株PCR分析的電泳圖譜
[0055]圖14為轉整合gfp基因的優化及未優化載體T1代煙草植株PCR分析的電泳圖譜
[0056]圖15為轉整合印sps基因的優化及未優化載體Ttl代水稻植株PCR分析的電泳譜
[0057]圖16為轉整合印sps基因的優化及未優化載體T1代水稻植株PCR分析的電泳圖譜
[0058]圖17為載體pCDmar-npt的物理圖譜【具體實施方式】
[0059]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0060]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0061]下述實施例構建過程中質粒提取、酶切、DNA的回收、純化均按分子克隆中的方法進行(分子克隆:實驗室手冊，Sambrook et al, New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。
[0062]實施例1、雙T-DNA植物載體pDTmar-hyg和pDTmar-npt的構建
[0063]一、雙T-DNA植物載體pDTmar-hyg的構建
[0064]1、中間載體pC1300LacZ-的獲得
[0065]EcoRI 和 HindIII(NEB)雙酶切 pCAMBIA1300(Roberts C，et al.1994.Plant Mol.Biol.25(6):989-994 ;公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)，收集8907bp的載體骨架，然后用Klenow(NEB)補平載體骨架的酶切位點，自連，獲得無多克隆位點的中間載體pC1300LacZ-(載體示意圖如圖1)。
[0066]2、雙 T-DNA 植物載體 pDTmar-hyg 獲得
[0067]以載體pCDMAR-hyg (載體示意圖如圖2，DREB基因雙T-DNA植物表達載體的構建及驗證，分子植物育種，2004，2(1)，7-12 ;公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)為模板，以 primer-1:5-tgcaggatatcactgaacgtcagaagccgactgc-3, primer-2:5-tgcaggatatcatccaacccctccgctgctata-3 (下劃線為EcoRV酶切位點)為引物進行PCR擴增,得到2774bp的PCR產物(序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸)，其含有雙MAR序列(LiX G, et al.2001.Science in China (series C) 44:400-408)、多克隆位點、選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因的表達盒的T-DNA片段結構域。
[0068]用EcoRV酶切上述PCR產物，回收2753bp酶切片段；用SphI (NEB)酶切pC1300LacZ-載體，回收8907bp載體骨架；用T4DNA聚合酶(NEB)削平載體骨架的SphI酶切位點，得到平末端載體骨架；將2753bp酶切片段與平末端載體骨架連接，得到重組載體；
[0069]將 多個PCR鑒定為陽性的克隆進行測序分析，獲得插入方向正確的重組載體，命名為pDTmar-hyg (載體結構示意圖如圖3所示)。經過測序,載體pDTmar-hyg為將序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ-載體的SphI酶切位點間得到的載體，該載體包括雙T-DNA區域I,該區域的核苷酸序列為序列表中序列I所示,結構示意圖如圖4所示。
[0070]雙T-DNA區域I依次包括兩個獨立T-DNA區域:T_DNA區域A-1和T-DNA區域B ；TDNA區域A-1依次包括左邊界A、終止子CaMV35S polyA、潮霉素磷酸轉移酶編碼基因Hpt和啟動子35S ；T-DNA區域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的基因的多克隆位點、第一個MAR和左邊界B ；T-DNA區域A-1的右邊界A和T-DNA區域B的右邊界相鄰，且T-DNA區域A-1的左邊界A和T-DNA區域B的左邊界相離(即右臂相鄰)。
[0071]選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因(hygromycin phosphotransferase,Hpt)表達盒包括啟動子35S、基因Hpt和終止子CaMV35S polyA ；
[0072]上述用于插入目的基因的多克隆位點依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoRI ；
[0073]雙T-DNA區域I各部分的核苷酸序列如下所示:序列I自5’末端第1_26位核苷酸為左邊界A ;自5’末端第76-292位核苷酸為選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒的終止子T-nos ；自5’末端第320-1342位核苷酸為選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因；自5’末端第1378-2147位核苷酸為選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒的啟動子35S ;自5’末端第2653-2678位核苷酸為右邊界A ;自5’末端第2893-2919位核苷酸為右邊界B ;自5’末端第2965-3712位核苷酸為第二 MAR ;自5’末端第3928-3985位核苷酸為用于插入目的基因的多克隆位點；自5’末端第4248-5110位核苷酸為第一MAR ;自5’末端第5385-5410位核苷酸為左邊界B。
[0074]二、雙 T-DNA 植物載體 pDTmar-npt
[0075]EcoRI和ClaI (NEB)雙酶切質粒pCASmGFPt (載體結果示意圖如圖5，中國科學院博士研究生學位論文“一種轉錄后基因沉默機制的研究”，劉翔，2004年，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)，收集2298bp的酶切產物，該酶切產物包括新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒；新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒包括nos啟動子、新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)和nos終止子。
[0076]將2298bp的酶切產物用Klenow酶(NEB)補平EcoR1、ClaI酶切位點，得到平末端酶切產物；再將pDTmar-hyg用Xhol/Pmel酶切，收集9327bp的載體骨架，用Klenow酶(NEB)補平載體骨架的XhoI酶切位點，得到平末端載體骨架；將平末端酶切產物和平末端載體骨架鏈接，得到雙T-DNA載體pDTmar-npt (為將新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒取代pDTmar-hyg的Xhol/Pmel酶切識別位點間的小片段(潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒)得到的重組載體pDTmar-npt)。
[0077]將多個PCR鑒定為陽性的克隆進行測序分析，獲得插入方向正確的重組載體，命名為pDTmar-npt(載體結構示意圖如圖6所示)。經過測序，載體pDTmar-npt包括雙T-DNA區域2，該區域的核苷酸序列為列表中序列2所示，結構示意圖如圖7所示。[0078]雙T-DNA區域2依次包括兩個獨立T-DNA區域:T_DNA區域A-2和T-DNA區域B ；T-DNA區域A-2包括左邊界A、nos終止子、新霉素磷酸轉移酶基因和nos啟動子、右邊界A ；T-DNA區域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的基因的多克隆位點、第一個MAR和左邊界B ；T-DNA區域A-2的右邊界A和T-DNA區域B的右邊界相鄰，且T-DNA區域A-2的左邊界A和T-DNA區域B的左邊界相離(即右臂相鄰)。
[0079]選擇標記基因nptll表達盒包括nos啟動子、新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)和nos終止子；
[0080]上述用于插入目的基因的多克隆位點依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoRI ；
[0081]雙T-DNA區域2各部分的核苷酸序列如下所示:序列表中序列2自5’末端第1_26位核苷酸為左邊界A ;自5’末端第545-800位核苷酸為選擇標記基因nptll表達盒的終止子nos、自5’末端第1013-1996位核苷酸為選擇標記基因nptll、自5’末端第1997-2303位核苷酸為選擇標記基因nptll表達盒的nos啟動子、自5’末端第2618-2643位核苷酸為右邊界A、自5’末端第2858-2883位核苷酸為右邊界B、自5’末端第2930-3676位核苷酸為第二 MAR、自5’末端第3893-3950位核苷酸為用于插入目的基因的多克隆位點、自5’末端第4213-5074位核苷酸為第一 MAR、自5’末端第5349-5374位核苷酸為左邊界B。
[0082]實施例2、雙T-DNA植物表達載體pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg的構建
[0083]一、雙T-DNA植物表達載體pDTgfp-npt的構建
[0084]XhoI和BglII (NEB)雙酶切中間載體pSPmGFP5 (中國科學院博士研究生學位論文“一種轉錄后基因沉默機制的研究”，劉翔，2004年，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；載體構建示意圖如圖8)，得到1989bp的酶切產物，該酶切產物包括綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達盒，該表達盒包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因(mgfp5)和nos終止子組成的表達盒(該表達盒的核苷酸序列為序列3)。
[0085]將該酶切產物用Klenow酶(NEB)補平XhoI和BglII酶切位點，得到平末端酶切產物；再將由實施例1得到的載體pDTmar-npt用SmaI (NEB)酶切，回收11624bp的載體骨架；再將平末端酶切產物和載體骨架鏈接，得到雙T-DNA表達載體pDTgfp-npt，該表達載體的結構示意圖如圖9所示。
[0086]經過測序鑒定方向，且該表達載體pDTgfp-npt為將序列表中序列3所示的綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達盒插入pDTmar-npt載體的SmaI酶切位點間得到的載體。
[0087]序列3自5’末端第30-878位核苷酸為CaMV35S啟動子、自5’末端第884-1701位核苷酸為綠色熒光蛋白基因(mgfp5)、自5’末端第1702-1967位核苷酸為nos終止子。
[0088]從圖9的結構示意圖可以看出，雙T-DNA表達載體pDTgfp-npt含有兩個方向相反且獨立的T-DNA區，其中一個T-DNA包含新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒作為選擇標記基因，另一個T-DNA包含綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達結構盒作為報告基因，代表目的基因。在報告基因的兩側同時還含有兩段同向來源于豌豆的MAR序列，該序列可以提高和穩定外源基因在受體植物中的表達(Li X G, et al.2001.Science in China (seriesC)44:400-408)。
[0089]二、雙T-DNA植物表達載體pDTepsps-hyg的構建
[0090] XmnI和SbfI (NEB)雙酶切質粒pQ)epsps_hyg(載體結構示意圖如圖10,該載體的核苷酸序列為序列表中的序列5，雙T-DNA順勢連接，LB-RB-LB-RB)含有兩個同向且獨立的T-DNA區)，得到4222bp的酶切產物；該酶切產物包括5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶表達盒，該表達盒包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase, EPSPs)基因和nos終止子(該表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列4)。
[0091]將由實施例1得到的載體pDTmar-hyg用SmaI和SbfI (NEB)酶切，回收11637bp的載體骨架，將4222bp的酶切產物與11637bp的載體骨架連接，得到雙T-DNA植物表達載體pDTepsps-hyg (載體結構示意圖如圖11)。
[0092]載體PDT印sps-hyg為將序列表中序列4所示的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶基因表達盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位點間得到。
[0093]序列4自5’末端第2198-4108位核苷酸為Ρ-Ubi啟動子、自5’末端第554-2197位核苷酸為EPSPs、自5’末端第285-574位核苷酸為nos終止子。
[0094]實施例3、對照雙T-DNA植物表達載體pCDgfp-npt的構建[0095]XhoI和BglII (NEB)雙酶切中間載體pSPmGFP5，得到1989bp的酶切產物，該酶切產物包括綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達盒，該表達盒包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因(mgfp5)和nos終止子組成的表達盒(序列3)。
[0096]將該酶切產物用Klenow酶(NEB)補平XhoI和BglII酶切位點，得到平末端酶切產物；再將載體pCDmar-npt (載體結構示意圖如圖17，該載體的核苷酸序列為序列表中的序列6，雙T-DNA順勢連接，為LB-RB-LB-RB ；)用SmaI (NEB)酶切，回收11643bp的載體骨架；再將平末端酶切產物和載體骨架鏈接，得到雙T-DNA表達載體P⑶gfp-npt，該表達載體的結構示意圖如圖12所示。
[0097]經過測序驗證插入方向正確,且該表達載體pCTgfp-npt為將序列表中序列3的綠色突光蛋白基因(mgfp5)表達盒插入pCDmar-npt載體的SmaI酶切位點間得到的載體。
[0098]從圖12的結構示意如可以看出，雙T-DNA表達載體P⑶gfp-npt含有兩個同向且獨立的T-DNA區，其中一個T-DNA包含新霉素磷酸轉移酶基因(nptll)表達盒作為選擇標記基因，另一個T-DNA包含綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達結構盒作為報告基因，代表目的基因。在報告基因的兩側同時還含有兩段同向來源于豌豆的MAR序列，該序列可以提高和穩定外源基因在受體植物中的表達(Li X G, et al.2001.Science in China (seriesC)44:400-408)。
[0099]實施例4、雙T-DNA植物表達載體pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg在培育無選擇標記轉基因植物或抑制雙T-DNA連鎖中的應用
[0100]一、雙T-DNA植物表達載體pDTgfp-npt在培養無選擇標記轉基因煙草或抑制雙T-DNA連鎖中的應用
[0101]1、煙草轉化植株的獲得
[0102]I)葉盤法轉化煙草
[0103]利用改良葉盤法，通過農桿菌介導轉化煙草。
[0104]參照BIO-DAD公司電激儀的說明書，將優化后的植物表達載體pDTgfp-npt及其未優化的對照載體pO)gfp-npt通過電激法轉化到根癌農桿菌LBA4404 (Luo, et al.2006.Plant Cell R印25:403 - 409，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)中，得到農桿菌LBA4404/pDTgfp-npt (提取質粒，用SalI和KpnI酶切，得到2013bp的為陽性)和LBA4404/pCDgfp-npt (提取質粒，用SalI和KpnI酶切，得到1955bp的為陽性)。
[0105]將農桿菌LBA4404/pDTgfp_npt 和 LBA4404/pCDgfp_npt 在含有 kanamycin50mg/L的YEB固體培養基上劃線，28°C避光培養至長出直徑約Imm大小的單菌落(約2_3天)，單菌落再度轉接于同樣的固體培養基上，培養至生長旺盛期(約2-3天)。取少許農桿菌LBA4404/pDTgfp-npt 和 LBA4404/pCDgfp_npt 轉接于 20ml 的 YEB 液體培養基中(kanamycin50mg/L)于28°C，220rpm振蕩培養過夜(約16小時)。次日以2% _4%的接種量轉接于20ml不含抗生素的YEB液體培養基中，并補加乙酰丁香酮(AS)至終濃度為100 μ M。繼續振蕩培養3-4小時，到達對數生長中期時，用3.5倍體積的YEB液體培養基稀釋至肉眼稍見渾池即可(OD6tltl=0.1)作轉化用，得到農桿菌 LBA4404/pDTgfp_npt 和 LBA4404/pQ)gfp-npt菌液。
[0106]取完全展開的野生本氏煙草(Nicotiana benthamiana)(以下簡稱為野生型煙草；Baulcombe et al., The Plant Journall995.67:1045-1053 ;公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)無菌苗葉片，用打孔器(直徑0.9cm)制成葉盤，在農桿菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt菌液中浸泡8分鐘。取出葉盤,用無菌濾紙吸干后，轉入覆蓋有一層無菌濾紙的共培養培養基(MS基本培養基+蔗糖30g/L + 6BA1.0mg/L +IAA0.lmg/L)中于25°C暗培養3天后，再將葉盤轉入繼代培養基(MS基本培養基++蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L + IAA0.lmg/L +頭孢噻肟鈉500mg/L)中，在繼代培養基中光照培養(光/暗周期為16/8小時)3天后，再將葉盤轉入篩選培養基(MS基本培養基+蔗糖 30g/L + 6-BA1.0mg/L + IAA0.lmg/L + 頭抱噻月虧鈉 500mg/L + kanamycin80mg/L),繼續培養10天后，將葉盤轉入再生培養基(MS基本培養基+蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L +頭孢噻廂鈉500mg/L + kanamycin80mg/L)。一個月左右葉片邊緣長出再生芽至l_2cm,轉入新的再生培養基中(MS基本培養基+蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L +頭孢噻肟鈉500mg/L + kanamycin80mg/L)。再生芽長到3_4cm時,用解剖刀將再生芽切下,并轉入生根培養基(MS基本培養基+蔗糖20g/L + kanamycin50mg/L)中，待再生芽在培養基中生根，并長成獨立植株時，移栽至蛭石并在溫室中進行繼續培養，得到Ttl代轉pDTgfp-npt煙草和Ttl代轉pO)gfp-npt 煙草(對照)。
[0107]2) T0代轉基因煙草植株的分子檢測驗證雙-DNA連鎖
[0108](1)、煙草DNA的提取
[0109]CTAB法提取Ttl代轉基因煙草的基因組DNA，具體如下:分別取Ttl代轉pDTgfp-npt煙草和Ttl代轉pCDgfp-npt煙草(對照)的新鮮葉片0.3mg置于研缽中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml60°C預熱的CTAB緩沖液(30g/L CTAB, 1.4mol/L NaCl，0.2%的巰基乙醇，20mmol/L EDTA，IOOmmoI/L Tris-HCl，pH8.0)。60°C保溫 30 分鐘，其間輕搖數次。然后加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，上清液轉移到新的離心管中加入2/3倍體積異丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少許洗液(體積分數為76%的乙醇，lOmmol/L NH4AC)洗滌沉淀一次,干燥后用 500 μ I TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl (pH8.0), lmmol/L EDTA)溶解DNA。隨后加入RNase A(終濃度10mg/L)，37°C保溫30分鐘，依次用等體積的苯酚、苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次，水相加入2.5倍體積無水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于60 μ I無菌水中，得到基因組DNA。[0110](2)、Ttl代轉基因煙草PCR檢測
[0111]對轉化優化后的載體pDTgfp-npt獲得的192個Ttl代轉pDTgfp-npt煙草植株及其轉化對照載體P⑶gfp-npt獲得的99個Ttl代轉p⑶gfp-npt煙草(對照)的基因組DNA進行PCR檢測，具體如下:
[0112]取I μ I基因組DNA做模板進行PCR反應；
[0113]nptll 基因的引物為:引物 1:N1，5’ -GAA, CAA, GAT, GGA, TTG, CAC, GCA, GG-3’ ；引物2:N2, 5’ -AAG, AAG, GCG, ΑΤΑ, GAA, GGC, GAT, GC-3’，擴增片段為 774bpnptII 基因；
[0114]mgfp5 基因的引物為:引物 1:M1，5’ -ACC, CAG, ATC, ΑΤΑ, TGA, AGC, GG-3’ ;引物 2:M2, 5’ -TTG, GGA, TCT, TTC, GAA, AGG, GC-3’，擴增片段為 415bpmgfp5 基因；
[0115]鑒定轉化優化后載體pDTgfp-npt的雙T-DNA插入連鎖的引物:引物1:W1，5’ CCA,GGC, TTT, ACA, CTT, TAT, GCT, TC-3，；引物 2:W2，5，-CTT, CTC, CTC, TAG, TAT, CTC, CCG, ATG-3，，擴增片段為472bp ；
[0116]鑒定轉化對照載體pCDgfp-npt的雙T-DNA插入連鎖的引物:引物1:W3，5’ TGA, CTC, CCT, TAA, TTC, TCC, GCT, CAT-3';引物 2:W4, 5’ -CGA, TAC, CGT, CGA, GTT, TCT, CCA, TA-3’，擴增片段為1145bp ；
[0117]上述每個PCR反應體系均包括:2μ 110XPCR反應緩沖液、0.5 μ IlOmM引物1、0.5 μ IlOmM引物2、1μ IDNA模板、2.5 μ 12.5mM dNTPs，補加無菌水至總體積20 μ I。每個PCR反應條件均為:94°C預變性5分鐘，94 °C變性30秒、54 °C復性30秒、72 °C延伸I分鐘，進行30個循環，最后72°C延伸5分鐘。
[0118]T0代轉pDTgfp-npt煙草植株PCR產物全部進行瓊脂糖電泳檢測，部分電泳結果如圖13A,為檢測轉化優化后載體pDTgfp-npt的部分電泳結果,其中M為IOObp DNA marker ；P為陽性質粒pDTgfp-npt ;N為野生型煙草，1-9為Ttl代轉pDTgfp-npt煙草植株,可以看出，
1-9均擴增出774bpnptII基因和415bpmgfp5基因，其中僅有5和6擴增出472bp，為Ttl代雙T連鎖檢測呈陽性植株，其余均為非雙T連鎖Ttl代轉pDTgfp-npt煙草植株。
[0119]T0代轉P⑶gfp-npt煙草(對照)PCR產物全部進行瓊脂糖電泳檢測，部分電泳結果如圖13B，為檢測對照載體pCDgfp-npt的部分電泳結果，其中M為IOObp DNA marker ;P為陽性質粒pCDgfp-npt ；N為野生型煙草，1-10為Ttl代轉pCDgfp-npt煙草(對照)，可以看出，
2-10均擴增出774bpnptll基因和2-6，8_10均擴增出415bp mgfp5基因，其中2-4, 6，8，10均擴增出1145bp，為Ttl代轉P⑶gfp-npt煙草(對照)雙T連鎖檢測呈陽性植株。
[0120]192個Ttl代轉pDTgfp-npt煙草PCR檢測結果顯示，nptll基因檢測呈陽性的Ttl代轉基因煙草共184株；nptll基因與mgfp5基因發生共轉化Ttl代轉pDTgfp-npt煙草有160個，二者共轉化率為86.96%，其中二者共轉化160個中經檢測雙T連鎖整合到煙草基因組的Ttl代轉pDTgfp-npt煙草共41株、連鎖頻率為25.63% (表1)，非雙T連鎖的整合到煙草基因組的Ttl代轉pDTgfp-npt煙草共119株、非連鎖頻率為74.37%。
[0121]99個Ttl代轉pCDgfp-npt煙草(對照)PCR檢測結果顯示，nptll基因檢測呈陽性的T0代轉基因煙草共95株；nptll基因與mgfp5基因發生共轉化Ttl代轉基因煙草有86個，二者共轉化率為90.53%，其中二者共轉化86個中經檢測雙T連鎖整合到煙草基因組的Ttl代轉P⑶gfp-npt煙草(對照)共38株、連鎖頻率為44.19% (表1)，非雙T連鎖的整合到煙草基因組的Ttl代轉pCDgfp-npt煙草(對照)共48株、非連鎖頻率為55.81%。[0122]表1為Ttl代轉基因煙草共轉化頻率及連鎖頻率
[0123]
【權利要求】
1.一種雙T-DNA載體A，包括雙T-DNA區域，所述雙T-DNA區域包括T-DNA區域A和T-DNA區域B ;所述T-DNA區域A依次包括左邊界A、選擇標記基因表達盒和右邊界A ;所述T-DNA區域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的DNA的多克隆位點、第一個MAR和左邊界B ;所述T-DNA區域A的右邊界A和所述T-DNA區域B的右邊界相鄰。
2.根據權利要求1所述的雙T-DNA載體A，其特征在于:所述選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉移酶編碼基因、膦絲菌素乙酰轉移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述選擇標記基因具體為潮霉素磷酸轉移酶編碼基因或新霉素磷酸轉移酶基因； 所述用于插入目的DNA的多克隆位點依次包括Hindlll、SphI, Pst、IXbaI, BamHI,Sma1、Sac1、EcoRI。
3.根據權利要求1或2所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 所述雙T-DNA載體A為如下I)或2): 1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域依次包括所述左邊界A、終止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因和啟動子35S、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點、所述第一個MAR和所述左邊界B; 2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域依次包括所述左邊界A、nos終止子、所述新霉素磷酸轉移酶基因和nos啟動子、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點、所述第一個MAR和所述左邊界B。
4.根據權利要求3所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域的核苷酸序列為序列表中的序列I; 2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域的核苷酸序列為序列表中的序列2。
5.根據權利要求3或4所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 1)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將含有所述T-DNA區域B片段插入含有所述T-DNA區域A的表達載體中，且使所述T-DNA區域A的右邊界A和所述T-DNA區域B的右邊界相鄰；所述含有所述T-DNA區域B片段的核苷酸序列具體為序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA區域A的表達載體具體為pC1300LacZ-； 2)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將新霉素磷酸轉移酶基因表達盒替換掉I)所述的雙T-DNA載體A中潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒得到的載體；所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因表達盒包括終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因和啟動子35S。
6.一種DNA片段，為權利要求1-5中任一所述雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區域。
7.一種雙T-DNA載體B，為將目的DNA插入權利要求1_5中任一所述的雙TDNA載體A的用于插入目的DNA的多克隆位點得到的載體。
8.根據權利要求7所述的雙T-DNA載體B，其特征在于:所述目的DNA以目的基因表達盒的形式插入； 所述目的基因表達盒具體為綠色熒光蛋白基因表達盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶基因表達盒； 所述綠色熒光蛋白基因表達盒進一步具體包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因mgfp5和nos終止子組成；所述綠色熒光蛋白基因表達盒的核苷酸序列進一步具體為序列表中的序列3 ； 所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達盒進一步具體包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos終止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達盒的核苷酸序列進一步具體為序列表中的序列4。
9.權利要求1-5中任一所述的雙T-DNA載體A或權利要求6所述的DNA片段或權利要求7或8所述的雙T-DNA載體B在抑制雙T-DNA插入植物基因組發生連鎖中的應用；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體煙草，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
10.權利要求1-5中任一所述的雙T-DNA載體A或權利要求6所述的DNA片段或權利要求7或8所述的雙T-DNA載體B在培育無選擇標記轉基因植物中的應用；所述植物具體為雙子葉植物 或單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體煙草，所述單子葉植物進一步具體為水稻。
【文檔編號】C12N15/11GK103898135SQ201210576396
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優先權日:2012年12月26日
【發明者】朱禎, 孫兵, 戴艷, 冷春旭 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所