專利名稱：一種鼠李糖乳桿菌及其培養和微膠囊方法
一種鼠李糖乳桿菌及其培養和微膠囊方法技術領域
本發明提供的是一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)及其培養和微膠囊方法。
背景技術：
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosusLC-STH-13)屬于乳桿菌屬，短小的桿菌；不運動，無芽孢，無質粒，革蘭氏染色陽性；兼性厭氧菌，生長溫度范圍2 53°C，最適溫度一般是30 40°C;耐酸，最適pH通常為5. 5 6. 2 ;—般在pH5或更低的情況下可生長。 上世紀80年代，由兩位美國科學家Gorbach和Goldin從健康人的腸道中分離而得,并命名為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG)LGG。近年來,大量的動物實驗和人體臨床實驗證明LGG具有相當多的生理功能和自身優勢，是目前全球研究最多的益生菌之一。
鼠李糖乳桿菌的生理生化特征在糖發酵中，苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖酸鹽、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、鼠李糖、核糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖均能被發酵，密二糖、綿子糖、木糖不能被發酵；精氨酸產 NH3 ;乳酸旋光性為L ;15°C能生長；肽聚糖類型為Lys-DAsp ;鼠李糖乳桿菌的DNA的鳥嘌呤 (G) +胞嘧啶(C)的含量為45 47% ;極少見硝酸還原反應，只有PH值最終平衡在6. O以上時才能還原硝酸鹽；不液化明膠；不分解酪素，但大多數菌株能產生少量的可溶性氮；不產吲哚和H2S ;接觸酶陰性；無細胞色素，極少數菌株以假接觸酶分解過氧化物；聯苯胺反應陰性。
鼠李糖乳桿菌的生理功能LGG具有顯著生理功能，可歸納為以下六方面
1.平衡腸道菌群，抑制腹瀉的功能腸道微生態平衡是指腸道中正常菌群與宿主在不同的發育階段的動態的生理性組合狀態。由于腸道微生態平衡失調，即菌群失調而引起腸道功能紊亂，出現腹瀉等癥狀在臨床上屢見不鮮。近年來新的廣譜抗生素不斷出現，再加上抗生素濫用、工作壓力大、飲食不健康等多種因素的共同影響，腸道菌群平衡受到了極大的挑戰，大量的研究人員對此進行了深入的研究。Siitonen等報道了以LGG發酵的酸奶對由抗生素引起的腹瀉的治療作用。Hilton等通過對美國去亞洲、東非、南美等地的旅行者腹瀉發病情況進行研究，發現每天口服LGG膠囊可預防旅行腹瀉的發生，并且發現LGG對從未發生旅行腹瀉者更為有效。Kaila等對患有輪狀病毒引起腹瀉的29名5 28月嬰兒分別口服含LGG的制劑和普通牛乳，結果在服用LGG制劑的嬰兒糞便中檢出LGG菌株，說明即使是在宿主患急性胃腸炎 期間，LGG仍能夠促進腸道菌群的平衡。Oberhelman等通過對 204名6 24月營養不良的嬰兒臨床實驗發現，服用含LGG的制劑后腹瀉時間縮短，糞便中的腺病毒明顯減少，該療效對非母乳喂養的嬰兒更為顯著，并證實了 LGG對秘魯兒童急性腹瀉具有明顯的預防作用。與大多數研究不同的是，Sazawal等通過對34位不同年齡受試者服用LGG益生菌發現，在降低急性腹瀉風險方面，LGG對兒童的效果(降低57% )高于成人(降低26% )，并提出LGG對急性腹瀉的預防與患者年齡有一定的關系。
2.在腸道中定植和存活，增強胃腸道粘膜屏障的功能
益生菌只有通過定殖和存活于粘膜、皮膚等表面或細胞之間形成的生物屏障，競爭性地抑制病原菌的生長和阻止病原菌的侵入，同時通過防止毒素等的吸收和中和有毒產物。已有大量的實驗論證了益生菌在腸道中定植和存活的特性。Kirjavainen等用不同益生菌對人體腸黏膜的結合能力測定發現，LGG對于嬰兒和成年人，均有較高的黏著率。Alander 等讓志愿者連續12天服用含有LGG乳清飲料后，對受試者腸道內容物和糞便樣品進行檢驗，發現樣品中都含有LGG囷株，這證實了 LGG能夠在活體腸道內定植并存活。Lam等對患有胃潰瘍的小鼠以每天108cfu/day或109cfu/day的LGG持續3天進行灌胃實驗,發現LGG 成功附著在胃粘膜上，尤其在潰瘍部位的邊緣定植，而且通過服用一定劑量的LGG，潰瘍面積明顯減少。實驗發現，將LGG與不同益生菌的結合使用可以更好的抑制病原菌對腸粘膜的黏附，并提出可以通過對益生菌不同的組合來抑制目的病原體。Fang等將純化和分離的 LGG分泌的蛋白作用于腸上皮細胞，發現LGG分泌蛋白可以通過特殊的路徑促進腸上皮細胞的動態平衡，對因細胞因子引起的胃腸道疾病具有預防作用。
3.提高機體免疫力的功能
人體的免疫系統分為先天和適應性免疫系統，當有先天免疫系統無法識別入侵的微生物時，適應性免疫系統開始發生作用。二者共同構成了人體的免疫屏障。非特異性免疫在抵抗微生物侵襲中所起到的重要作用已越來越為人們所認同。已有實驗表明，乳酸菌及其細胞壁成分能夠促進人體外周血單個核細胞分泌腫瘤壞死因子、白細胞介素_6和白細胞介素-10，增強人體免疫力。Miettinen等在實驗中發現，LGG與血液中細胞因子的反應能夠抑制食物中革蘭陰性致病菌引起的免疫功能失調，并誘導產生較多的腫瘤壞死因子、 白細胞介素_6和白細胞介素-10。Jeremy等報道了 LGG能夠調節腫瘤壞死因子等細胞因子的分泌，其進行的鼠腸道微生物菌群體外實驗結果顯示，LGG能夠防止巨噬細胞分泌過量的腫瘤壞死因子，起到預防和治療結腸炎的作用，但并未發現對白細胞介素-10有明顯影響，推測LGG可能通過分泌可溶性分子防止巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子。Rinne等對96名哺乳期的婦女服用LGG和安慰劑后，通過檢測內臟微生物生態區、體液免疫反應、初乳可溶性CD14等狀況，發現LGG和母乳喂養對分泌抗體細胞的數量有關系，提出母乳喂養期間服用LGG可以提高內臟的免疫性。
4.減少和消除體內和食物毒素的功能
體內 毒素積累來源于兩條途徑一是環境污染、食物毒化；二是體內代謝產物聚積。黃曲霉毒素主要存在于霉變的花生、谷物、果仁和大米等食物中，危害大，存在范圍廣。 大量的實驗報道了 LGG對黃曲霉毒素BI具有很好的清除作用。Kankaanpa等也報道了 LGG 在Caco-2模型中對黃曲霉毒素的吸附作用。Klein等報道了 LGG對萬古霉素具有抗性。 EL-Nezami等通過實驗發現，LGG可以很好的去除普通鐮刀酶毒素和單端胞酶烯(被認為與食物中毒性白細胞缺乏癥、大骨節病、克山病三種地方病病因有關)。Hahtunen等的實驗證實了 LGG能夠去除食物中的重金屬鎘。家庭飲用水已經是生活中不可小覷的部分，健康的飲用水可以說是身體健康的根本，存在于淡水中的藍藻可以釋放微囊藻素，可以引起急性肝中毒，甚至癌癥。Meriluoto通過實驗發現LGG可以減少來自藍藻縮氨酸微囊藻毒素，證實了攝入LGG益生菌可以減少因飲用水中的微囊藻素引起疾病的概率。
5.抑制腸道內有害菌生長的功能
Chen等報道了 LGG粘液素分泌的增加還可以減少輪狀病毒對腸細胞的入侵。Mattar等報道LGG可以減少大腸桿菌在Caco_2單細胞模型中的遷移率，且LGG濃度越高， 大腸桿菌的遷移率就越低。次年，Mattar等又報道了 LGG可以通過增加粘液素的分泌而減少大腸桿菌在Caco-2和HT-29細胞模型中的粘附。Hudai等通過Caco_2或海拉(Hela)細胞模型研究表明LGG不會侵入腸細胞，而且可以減少鼠傷寒沙門氏菌的侵入。Vesterlund 等采用設計的腸道模型，通過分析腸道益生菌和致病菌對腸道的粘附以及其之間的相互關系發現LGG不影響鼠傷寒桿菌的定植和生存能力，相反鼠傷寒桿菌可以通過取代置換反應減少LGG的定植。Makras等采用Caco-2/TC7細胞模型對益生菌抗鼠傷寒桿菌SL1344活性動態分析發現，LGG抗菌活性只歸因于其產生的乳酸。
6.其它功能
在預防齲齒方面的研究顯示，研究者認為長期攝入含有LGG的牛奶可以降低兒童患頻齒的風險。Bruzzese等通過實驗發現LGG能夠減少囊腫性纖維化病人的肺部惡化,提出益生菌可以延緩呼吸損傷，并且指出腸炎和肺炎之間存在一定的關聯。Caropreso等發現 LGG可以改善肥胖」L童高轉氨酶血癥。
不同的益生菌具有不同的特點，同許多其它益生菌相比，LGG具有以下優勢①全球研究最多、最徹底的益生菌之一。目前，LGG的研究文獻是所有益生菌中最多的，其安全性和功能性均有大量的科學實驗所證實。②低酸環境存活并可定殖于人體腸道。LGG忍受腸道環境(如胃酸、膽汁等)的能力優于普通酸奶菌種和其它一些益生菌菌種。實驗證實，在 PH3. O條件下，LGG在胃中4小時活菌數幾乎沒有變化。LGG能夠以存活狀態通過人體胃部而進入腸道，并在腸道內定殖。③發酵過程僅產L-乳酸。LGG不能利用乳糖，但可利用一些單糖類，在發酵過程中，只會產生L-乳酸，而不會產生其它對產品口感有影響的酸類。④在產品保質期內活菌數保持穩定。研究表明，LGG在最終產品中的穩定性非常好。比如，LGG 酸奶在冷藏條件下，一個月的保質期內LGG活菌數幾乎保持穩定。而一些其它的益生菌則在產品(比如酸奶)生產后數天內活菌數以幾何級不斷衰減。
LGG的應用范圍十分廣泛主要包括酸奶或其它發酵乳制品、牛奶、新鮮干酩、硬質干酪、嬰兒食品、乳飲料或非乳飲料以及醫藥品，如膠囊、小包藥片等。LGG在國際上的應用，1987年，芬蘭維利奧公司獲得了 LGG的全球唯一授權。1990年，維利奧有限公司推出了第一個含有LGG的發酵奶，除了一些傳統產品的酸奶等發酵制品外，還包括果汁飲料、干酪、膠囊等。在芬蘭，很多醫院都使用LGG產品(乳制品和膠囊)。通常LGG用于那些免疫力十分低下的兒童，比如患有嚴重疾病或經過細胞毒素療法或愛滋病患者及血液學病人等。通過授權的方式，維利奧有限公司與全球各個國家的公司進行合作。目前，LGG產品已在全球近40個國家和地區生產和銷售，比如芬蘭、美國、日本、韓國、法國、德國等。LGG在全球范圍的成功歸因于大量保健功能方面的科技文獻以及菌株本身優異的技術特性。益生菌類產品及乳制品、在歐美、日本等一些國家已發展了很多年，而且深受廣大消費者的青睞。發明內容
本發明的目的在于提供一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosusLC-STH-13)及其培養和微膠囊方法。
本發明的目 的是這樣實現的
一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13),該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為=CGMCC NO. 3994 ;分類命名 Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13,保藏日期2012年7月8日，地址北京市朝陽區北辰西路I號院。
本發明還具有如下特征
1、所述的鼠李糖乳桿菌形態學特征為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀、不運動，無芽孢，菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑、中心突起和質地均勻。
2、所述的鼠李糖乳桿菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列為如序列表SEQ IDNo.1。
3、如上所述的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)的培養方法如下，培養基配方葡萄糖10. 0-95. Og/L、酵母粉5. 0-55. 0g/L、牛肉粉5. 0-40. 0g/L、大豆蛋白胨 2. 0-50. 0g/L、KH2PO4 0. 5-5. 0g/L、無水乙酸鈉 0. 1-5. 0g/L、檸檬酸銨 0. 1-3. Og/ L、吐溫 800. 5-4. 0mL/L、MgSO4 · 7H20 0. 1-2. 0g/L、MnSO4 · 4H20 0. 2-1. 0g/L、乳清粉 10. 0-30. 0g/L、低聚果糖 10. 0-50. 0g/L、酪蛋白水解物 5. 0-25. 0g/L, ρΗ4· 5-6. 5，培養溫度 32-37 °C，發酵時間為10-36h。
4、如上所述的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)的微膠囊方法，如下培養結束后，5000rpm離心，然后加入凍干保護劑進行微膠囊包埋，微膠囊包埋劑配方脫脂乳粉50. 0-200. 0g/L、甘油10. 0-50. 0g/L、海藻糖50. 0-200. 0g/L、Y -聚谷氨酸 10. 0-50. 0g/L;包埋劑與濕菌泥的比例為質量比1: 1，混合均勻后，進行冷凍干燥，制得凍干菌粉，凍干菌粉的活菌數彡1.0X101(lCfU/g。
本發明的優點
(I)本菌種生長周期短，繁殖速度快，產乳酸濃度高。
(2)能在腸道中定植和存活，增強胃腸道粘膜屏障的功能，具有改善胃腸道的功能，能抑制有害菌的定植。
(3)本菌種可在低酸環境存活，忍受腸道環境(如胃酸、膽汁等)的能力強并可定殖于人體腸道。可利用一些單糖類，發酵過程僅產L-乳酸。
(4)鼠李糖乳桿菌及其細胞壁成分能夠促進人體外周血單個核細胞分泌腫瘤壞死因子，具有提聞機體免疫力的功能。
(5)經微膠囊包埋后，鼠 李糖乳桿菌抵抗不良環境的能力更強。


圖1為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)平板培養特征圖2 為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)顯微鏡圖。
具體實施方式
下面舉例對本發明作更詳細的描述
實施例1
本實施例中所涉及的百分比均為重量百分比。
1.首先從正常成年人糞便中采集樣品，將采樣工具及各種采樣容器進行滅菌，進行多點采樣。
2.將采集的樣品進行稀釋將采集的某種樣品在無菌條件下混合均勻，稱取20克樣品，溶解于IOOmL無菌水中，其中裝有80-100粒玻璃珠，用力搖動10分鐘，靜止一分鐘， 用ImL無菌吸管吸取ImL上清液，移入9mL無菌水試管中，徹底搖勻，然后再從這一稀釋的樣品中取出ImL樣品再移入9mL無菌試管中，徹底搖勻，如此依次進行稀釋，直至稀釋到 10'
3.涂布分離從上述稀釋的樣品中用O.1mL無菌吸管分別取出O.1mL樣品，移入BCP瓊脂平板培養基中，用無菌三角刮棒，涂布均勻，每個稀釋度做3個重復。BCP培養基配方(g/100mL):葡萄糖O. 5g、乳糖O. 5g、酵母浸粉O. 5g、瓊脂1. 5 2. 0g、溴甲酹紫 (5g/100mL)1. OmL、自來水 IOOmL, pH 6· 8 7· O。
4.培養將涂布的平板置于37°C培養箱中倒置培養24小時,觀察挑菌。
5.挑菌將黃色菌落或培養基周圍變為黃色的菌落挑入試管斜面中，挑取200個菌落，然后再進行二次分離純化，最后得到純培養，從上述200株菌種中選出兩株黃色圈最大者，進行紫外線照射誘變。
6.紫外線誘變初篩將其中兩株菌分別在MRS培養基中進行培養12小時，取出離心，用無菌水洗滌兩次，再用生理鹽水稀釋，用玻璃珠搖勻打碎，使細胞數達到107，在15W紫外燈下，距離IOcm照射3分鐘，紅光下操作，然后涂布于上述瓊脂平板上，避光培養36小時。挑取黃色圈大的菌落，移入試管斜面中，挑取50株菌株。
7.復篩將50株菌種逐個進行培養產酸和凝乳性能測試，從其中篩選出2株性能最佳者，再進行誘變篩選，反復進行3次，最后得到一株最優良菌種LC-STH-13。
8.根據《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第9版，進行形態學、生理生化和16srDNA菌種鑒定。
菌落形態特征描述在MRS固體培養基上生長的單一菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑、菌落中心突起、質地均勻。
菌種個體形態特征光學顯微鏡觀察到，菌體呈短桿狀、無芽孢、無運動性，革蘭氏染色陽性。
經試驗，初步確定該菌株為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus),菌株編號為 LC-STH-13 ο
9.然后將菌株LC-STH-13送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行最后鑒定，鑒定結果如下表
中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心鑒定結果
權利要求
1.一種鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13),該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCCN0. 3994。
2.根據權利要求1所述的一種鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于所述的鼠李糖乳桿菌形態學特征為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀、不運動，無芽孢，菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑、中心突起和質地均勻。
3.根據權利要求1所述的一種鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于所述的鼠李糖乳桿菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列為如序列表SEQ IDNo.1。
·3.根據權利要求1所述的一種鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于，培養方法如下，培養基配方為葡萄糖10. 0-95. Og/L、酵母粉5. 0-55. Og/L、牛肉粉 5. 0-40. 0g/L、大豆蛋白胨 2. 0-50. 0g/L、KH2PO4O. 5-5. 0g/L、無水乙酸鈉 0. 1-5. Og/L、檸檬酸銨 0. 1-3. 0g/L、吐溫 800. 5-4. 0mL/L、MgSO4 · 7H20 O. 1-2. 0g/L、MnSO4 · 4H200.2-1. 0g/L、乳清粉 10. 0-30. 0g/L、低聚果糖 10. 0-50. 0g/L、酪蛋白水解物 5. 0-25. 0g/L,pH 4. 5-6. 5，培養溫度32-37 °C，發酵時間為10_36h。
4.根據權利要求3所述的一種鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13)的微膠囊方法，其特征在于，方法如下培養結束后，5000rpm離心，然后加入凍干保護劑進行微膠囊包埋，微膠囊包埋劑配方脫脂乳粉50. 0-200. 0g/L、甘油10. 0-50. 0g/L、海藻糖·50. 0-200. 0g/L、Y-聚谷氨酸10. 0-50. 0g/L ;包埋劑與濕菌泥的比例為質量比I 1，混合均勻后，進行冷凍干燥，制得凍干菌粉。
全文摘要
本發明公開一種鼠李糖乳桿菌及其培養和微膠囊方法，該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCC NO.3994，其拉丁文命名為Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13，形態學特征為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀、不運動，無芽孢，菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑和中心突起。本發明還公開了該菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列。本發明的優點菌種生長周期短，繁殖速度快，產乳酸濃度高。能在腸道中定植和存活，增強胃腸道粘膜屏障的功能，具有改善胃腸道的功能，抑制有害菌的定植；經微膠囊包埋后，本菌抵抗不良環境的能力更強。
文檔編號C12N11/04GK103031263SQ201210578720
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者梁金鐘, 肖文娟 申請人:哈爾濱美華生物技術股份有限公司