專利名稱：一種干酪乳桿菌及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明提供的是一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培養基。
背景技術：
干釀乳桿菌(Lactobacilluscasei L7-13)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),是革蘭氏陽性菌，不產芽孢，無鞭毛，不運動；兼性厭氧，有時微好氧，在有氧時生長差，降低氧分壓時生長較好；兼性異型發酵乳糖，不液化明膠，不還原硝酸鹽，接觸酶和氧化酶皆為陰性；最適生長溫度為37°C，G+C含量為45.6% 47.2% ;菌體長短不一，兩端呈方形，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時呈微黃色，能發酵多種糖。干酪乳桿菌分布廣泛，通常存在于人的口腔、腸道內含物和大便及陰道中，也常常出現在牛奶和干酪、乳制品、飼料、面團和垃圾中，罕見致病。干酪乳桿菌的生理功能(I)發酵后營養作用干酪乳桿菌發酵后產生乳酸，可提高鈣、磷、鐵的利用率，促進鐵和維生素D的吸收。乳糖分解產生的半乳糖，是構成腦神經系統中腦磷脂的成分，與嬰兒出生后腦的迅速生長有密切關系。眾所周知，有人患有乳糖不耐癥，若食用牛奶等鮮乳制品會引起腹瀉，而發酵乳發酵消耗原奶中20% 40%的乳糖，當引用酸奶后，還有一部分乳糖酶在繼續起作用，有利于腸的消化。還有助于防止缺鐵、缺鈣引起的貧血癥和軟骨病。結腸粘膜不能自己從血液中吸收營養，因此它的營養必須由腸道內的益生菌(多數是乳酸菌)產生。Bengmark等研究發現，胃腸道中的干酪乳桿菌能提供重要的營養、維生素和抗氧化劑，減少吸收食品中的有毒成分，防止食物腐敗，根除病原體。(2)改善胃腸道功能干酪乳桿菌通過自身及其代謝產物和其他細菌之間的相互作用，調整菌群之間的關系，維持和保證菌群最佳優勢組合及這種組合的穩定。胃腸道中各種微生物的種類、數量和定居部位 是相對穩定的，它們相互協調，相互制約，共同形成一個平衡的微生態系統。它們的數量取決于各自的活性，各種微生物都分泌特殊的物質抑制其他有害菌種的生長，乳酸菌正是其中的“佼佼者”。有害菌會產生腐敗代謝產物，如氨、硫化氫、吲哚等物質，這些有害物質會造成胃腸道功能異常，而優勢的乳酸菌可以產生多種抗菌物質，抑制有害菌的定植，這就是所謂的阻抗定位作用。干酪乳桿菌在體內發酵糖類，產生大量的乙酸和乳酸，使腸道內PH和Eh下降，腸道處于酸性環境，對于病原性細菌，如志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有拮抗作用。低PH和Eh能維持正常生理功能，對腸炎、痢疾、急慢性腹瀉、結腸炎等多種腸道疾病有良好的預防和治療作用。干酪乳桿菌在代謝過程中可以產生H2O2，抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖。在腸道中，產H2O2的干酪乳酸菌同時在代謝過程中產生乳酸，增強了 H2O2的殺菌作用，從而使乳酸菌成為腸道中的優勢菌。(3)抗腫瘤作用關于乳酸菌的抗腫瘤作用的報道是Bogdanov (1962)，他從保加利亞乳桿菌中分離出了 3種具有抗癌活性的糖肽。1978年，Kilara和Shahani報道，乳酸菌對抑制腫瘤細胞的增殖有一定效果，光崗知足也得到了類似的結果。1980年Kato等研究了干酪乳桿菌的抗腫瘤作用。1990年，Macleod等發現了干酪乳桿菌對抑制肝細胞腫瘤增長的功效。研究者們認為，乳酸菌的抗腫瘤活性是由于乳酸菌菌體本身及其代謝產物所致。目前這一研究已從推測進入實驗論證和機理闡明階段。雖然乳酸菌抑制腫瘤的真正機制目前并不十分清楚。但可大致歸納出6項可能的作用機理，包括:①降解或者吸附致癌物改善腸道菌群，阻止腸內致癌物的形成；③增強宿主免疫系統；④產生抗突變物質；⑤改變腸道的生理生化環境；⑥影響宿主的生理機能。(4)降低膽固醇作用膽固醇在人體內具有重要的生理作用，但血清中膽固醇含量過高容易誘發動脈硬化，從而導致一系列心血管疾病。在一些人民生活富裕的國家，因血液中膽固醇含量過高引發的心血管疾病，已經成為威脅人類身心健康的最大殺手。近年來國外的研究表明，乳酸菌具有較高的降低膽固醇作用，適量服用乳酸菌及乳酸菌發酵產品可以有效降低血液膽固醇含量，從而減少心血管疾病的發病概率。1977年，美國調查發現經常飲用酸奶和相關發酵乳制品的人，其體內血清膽固醇含量也較低。長期以來，人們對乳酸菌降低膽固醇作用及其機理進行了廣泛而有效的研究。盡管大量的體內和體外實驗都證實了乳酸菌的降低膽固醇作用，但其作用機理至今尚未定論，通常認為是幾種理論協同作用的結果。①體外研究證明，在厭氧條件下，乳桿菌和雙歧桿菌在含有膽鹽的高膽固醇培養基生長時，能降低培養基中膽固醇含量，人們推測細菌細胞吸收了腸道中的膽固醇，可能會減少機體對膽固醇的吸收,從而導致體內血清中膽固醇含量也相應下降。②體外實驗證明，乳酸菌產生的膽鹽水解酶可以將結合膽酸分解為游離膽酸，而游離膽酸則可以和膽固醇形成復合物共同沉淀下來。這就是乳酸菌與膽固醇的共沉淀作用。這種共沉淀作用可以使環境中的膽固醇含量降低。(5)增強機體免疫作用致病微生物(病毒、病菌、支原體等)廣泛存在于自然界中，并且不斷產生新的變異體， 不僅導致人體產生各種炎癥，甚至引發腫瘤等惡性疾病。現有疫苗和抗生素往往只能針對某些已知的致病微生物引起的疾病進行治療，而對其變異體則無能為力。因此，通過提高人體的免疫力來預防和治療各種致病微生物引起的疾病，日益成為各國科學家關注的熱點。今年研究表明:乳桿菌可以作為特異性免疫調節因子，增強腸道非特異性免疫能力，促進巨噬細胞產生TNA-a和IL-6，激活淋巴細胞，增加血液中免疫球蛋白的含量，從而提高機體抵抗病原體的能力。乳酸菌的細胞壁主要是由肽聚糖、多糖和磷壁酸組成。已知肽聚糖對免疫反應具有促進作用。對溶菌酶消化作用十分敏感的乳酸菌可能在腸道中釋放肽聚糖，并在胃腸黏膜表面產生誘導免疫反應。研究證明，用干酪乳桿菌的發酵液經加熱殺死活菌后仍能增強免疫反應，說明乳酸菌發酵產物也能增強機體的免疫力。乳酸菌發酵制品中，還有大量的短鏈多肽、游離氨基酸，不飽和脂肪酸，同時乳酸菌發酵液中的各種可溶態的微量元素也大大高于發酵前的培養基。酪蛋白水解后產生一種活性六肽，它可以刺激巨噬細胞的吞噬作用，同時還能刺激T細胞和白細胞的增殖和成熟，從而提高機體的免疫力，抵抗病原菌的入侵。(6)延緩機體衰老自從俄國作家梅切尼科夫的著作《長壽說》問世以來，乳酸菌能延長人的壽命已經有了很多證據。梅切尼科夫的研究表明，保加利亞人的長壽證實因為他們喜歡喝酸奶，而酸奶是由乳酸菌發酵而成的。人從嬰幼兒、青少年、壯年直至老年，由于生理變化，腸道內的微生物數量、種群和優勢菌群也不斷發生變化。人在出生時沒有乳酸菌；青壯年時，乳酸菌數量成為優勢菌，益生菌的數量達到頂峰；老年人體內的有害菌相對較多，益生菌數量相對較少。老年人的身體器官和機能都出去衰退時期，而乳酸菌可使腸內菌群平衡，加強乳酸菌等益生菌成為腸道內優勢菌的地位。日本光崗知足表明，長期飲用發酵乳，能夠增加老年人的免疫力，促進心、肝等器官的功能，達到延年益壽的目的。

發明內容
本發明的目的就提供一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)及其培養基，用于發酵乳制品工業中。—種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13),該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院，保藏日期:2010年7月2日，登記入冊編號為:CGMCC N0.3993。本發明還具有如下特征:1、所述的干酪乳桿菌形態學特征為:革蘭氏陽性菌，不產芽孢，無鞭毛，不運動，菌落粗糙，呈灰白色或微黃色。2、所述的干酪乳桿菌的16S核糖體DNA (16S rDNA)全序列為如序列表SEQIDN0.1。3、一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)的培養基，配方如下:溶劑為水，葡萄糖10.0-80.0g/L、低聚果糖10.0-50.0g/L、低聚木糖10.0-50.0g/L、大豆蛋白胨 10.0-30.0g/L、酵母浸粉 10.0-50.0g/L、牛肉粉 5.0-30.0g/L、磷酸氫二鉀 0.5-3.0g/L、檸檬酸三鈉 0.5-3.0g/L、檸 檬酸銨 0.1-3.0g/L、MgSO4.7H20 0.1-2.0g/L、MnSO4.4H200.1-1.0g/L、吐溫 80 0.l-20mL/L ;在 ρΗ4.5-6.5、溫度 30_42°C條件下培養 18-36 小時，菌體生長良好。本菌種產乳酸速度快，產酸高；繁殖速度快，活力高，抗逆性強；具有改善胃腸道的功能，能抑制有害菌的定植；該菌種能產生膽鹽水解酶，可以將結合膽酸分解為游離膽酸，而游離膽酸則可以和膽固醇形成復合物共同沉淀下來，因此，該菌種具有降低膽固醇作用。


圖1為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)的光學顯微鏡照片；圖2為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)的電子顯微鏡照片。
具體實施例方式下面舉例對本發明作更詳細的描述:實施例1本發明的目的在于提供一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13)的分離和培養方法，本發明的目的是這樣實現的:本發明中所涉及的百分比均為重量百分比。1.首先從自然界中采集樣品:將采樣工具及各種采樣容器進行滅菌，采樣地點選擇在乳品生產廠附近下水道的淤泥中，養牛擠奶場的土壤中，堆放的鮮儲固態飼料內層中，進行多點采樣。2.將采集的樣品進行稀釋:將采集的某種樣品在無菌條件下混合均勻，稱取20克樣品，溶解于IOOmL無菌水中，其中裝有80-100粒玻璃珠，用力搖動10分鐘，靜止一分鐘，用ImL無菌吸管吸取ImL上清液，移入9mL無菌水試管中，徹底搖勻，然后再從這一稀釋的樣品中取出ImL樣品再移入9mL無菌試管中，徹底搖勻，如此依次進行稀釋，直至稀釋到10'3.涂布分離:從上述稀釋的樣品中用0.1mL無菌吸管分別取出0.1mL樣品，移入BCP瓊脂平板培養基中，用無菌三角刮棒，涂布均勻，每個稀釋度做3個重復。BCP培養基配方(g/100mL):葡萄糖0.5g、乳糖0.5g、酵母浸粉0.5g、瓊脂1.5 2.0g、溴甲酹紫(5g/100mL) 1.0mL、自來水 IOOmL, pH 6.8 7.0。4.培養:將涂布的平板置于37°C培養箱中倒置培養24小時，觀察挑菌。5.挑菌:將黃色菌落或培養基周圍變為黃色的菌落挑入試管斜面中，挑取200個菌落，然后再進行二次分離純化，最后得到純培養，從上述200株菌種中選出兩株黃色圈最大者，進行紫外線照射誘變。6.紫外線誘變初篩:將其中兩株菌分別在MRS培養基中進行培養12小時，取出離心，用無菌水洗滌兩次，再用生理鹽水稀釋，用玻璃珠搖勻打碎，使細胞數達到107，在15W紫外燈下，距離IOcm照射3分鐘，紅光下操作，然后涂布于上述瓊脂平板上，避光培養36小時。挑取黃色圈大的菌落，移入試管斜面中，挑取50株菌株。7.復篩:將50株菌種逐個進行培養產酸和凝乳性能測試，從其中篩選出2株性能最佳者，再進行誘變篩選，反復進行3次，最后得到一株最優良菌種L7-13。8.根據《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第9版，進行形態學、生理生化和16srDNA菌種鑒定。菌落形態特 征描述^MRS固體培養基上生長的單一菌落呈乳白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、菌落中心突起，質地均勻。菌種個體形態特征:光學顯微鏡觀察到，菌體呈細長的桿狀，部分有不規則的彎曲、無芽孢、無運動性，革蘭氏染色陽性。通過電鏡照片可看到，其菌體形態和光學顯微鏡下的形態基本一致。(附光學顯微鏡和電子顯微鏡照片圖1-2)生理生化實驗結果:(表I)
權利要求
1.一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei L7-13),該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為=CGMCC N0.3993。
2.根據權利要求1所述的一種干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei L7-13),其特征在于:所述的干酪乳桿菌形態學特征為:革蘭氏陽性菌，不產芽孢，無鞭毛，不運動，菌落粗糙，呈灰白色或微黃色。
3.根據權利要求1所述的一種干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei L7-13),其特征在于:所述的干酪乳桿菌的16S核糖體DNA (16S rDNA)全序列為如序列表SEQ ID N0.1。
4.根據權利要求1所述的一種干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei L7-13)的培養基，其特征在于，配方如下:溶劑為水，葡萄糖10.0-80.0g/L、低聚果糖10.0-50.0g/L、低聚木糖 10.0-50.0g/L、大豆蛋白胨 10.0-30.0g/L、酵母浸粉 10.0-50.0g/L、牛肉粉 5.0-30.0g/L、磷酸氫二鉀 0.5-3.0g/L、檸檬酸三鈉 0.5-3.0g/L、檸檬酸銨 0.1-3.0g/L、MgSO4.7H20·0.1-2.0g/L、MnSO4.4Η200.1-1.0g/L、吐溫 80 0.l_20mL/L ;在 ρΗ4.5-6.5、溫度 30-42。。條件下培養18-36小時，菌體生長良好。
全文摘要
本發明公開一種干酪乳桿菌及其培養基，該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGMCC NO.3993，其拉丁文命名為Lactobacillus casei L7-13，形態學特征為革蘭氏陽性菌，不產芽孢，無鞭毛，不運動，菌落粗糙，呈灰白色或微黃色。本發明還公開了該菌的16S核糖體DNA(16S rDNA)全序列；本菌種產乳酸速度快，產酸高；繁殖速度快，活力高，抗逆性強；具有改善胃腸道的功能，能抑制有害菌的定植；該菌種能產生膽鹽水解酶，可以將結合膽酸分解為游離膽酸，而游離膽酸則可以和膽固醇形成復合物共同沉淀下來，因此，該菌種具有降低膽固醇作用。
文檔編號C12N1/20GK103114052SQ201210578740
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者梁金鐘, 肖文娟 申請人:哈爾濱美華生物技術股份有限公司