專利名稱：以產(chǎn)甘油假絲酵母特征5.8S序列為整合位點的pURGAP載體構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有表達系統(tǒng)的整合載體以及由該整合表達載體轉(zhuǎn)化工業(yè)酵母細胞-產(chǎn)甘油假絲酵母；涉及蛋白質(zhì)表達基因工程領(lǐng)域，尤其是利用產(chǎn)甘油假絲酵母作為細胞工廠表達外源基因的研究領(lǐng)域，屬于微生物學，基因工程和分子生物學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerolgenesis)是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能的工業(yè)菌株，曾獲得國家發(fā)明二等獎，能在55%葡萄糖或15% NaCl的高滲透壓培養(yǎng)基上正常生長繁殖，具有耐高滲，目標產(chǎn)物高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)強度大的特點。C.glycerinogenes具有兩個顯著特性，即耐高滲透壓(超高濃醪發(fā)酵，節(jié)省提取能耗)和葡萄糖代謝途徑完備，是一個可基因改造、具有的很好應(yīng)用前景的潛在節(jié)能型模式菌株，對其進行遺傳改良和途徑工程改造就必須建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。雖然常用的實驗室酵母,如釀酒酵母S.cerevisiae的轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)十分成熟,但這些方法用于工業(yè)酵母菌株的基因改造不理想，嚴重阻礙采用基因工程手段對產(chǎn)甘油假絲酵母代謝途徑進行有目的的改造從而改進產(chǎn)甘油假絲酵母的性能，其主要原因是該工業(yè)酵母菌株的遺傳背景復雜多樣。 因此，這就需要根據(jù)工業(yè)酵母菌株自身的特點，如細胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特性、遺傳背景等，建立起相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體系。實現(xiàn)建立起相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體系這一目標首先要獲得有效的載體，而構(gòu)建酵母整合型載體的一項重要工作是獲得整合位點。為建立有效的產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，本發(fā)明選擇產(chǎn)甘油假絲酵母5.8S rDNA特征序列作為同源重組整合位點，構(gòu)建適合于產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化的整合載體，建立了一套高效、簡單的產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前未見產(chǎn)甘油假絲酵母5.8S rDNA序列在產(chǎn)甘油假絲酵母表達載體中應(yīng)用的現(xiàn)狀。本發(fā)明利用產(chǎn)甘油假絲酵母的特征5.8S rDNA序列SEQ NOl構(gòu)建產(chǎn)甘油假絲酵母整合表達載體如附

圖1所示，獲得了一種能夠顯著提高載體轉(zhuǎn)化效率的載體。本發(fā)明提供了以C.glycerinogenes 5.8S rDNA序列SEQ NOl為整合位點的重組表達載體的構(gòu)建，構(gòu)建整合表達載體的具體步驟:1.產(chǎn)甘油假絲酵母部分核糖體DNA(ribosome DNA, rDNA)序列的克隆:引物rdnal、rdna2擴增產(chǎn)甘油假絲酵母特征5.8S rDNA，特征5.8S rDNA的序列見SEQ N01。rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ;序列見 SEQ NOl。2.整合載體的構(gòu)建(PUC18作為基本骨架)如附圖2 ;(I)將PCR獲得的特征5.8S rDNA經(jīng)Sac I和Hind III連到pUC18上，得到克隆載體 pUC-5.8S rDNA ；
(2)將PCR獲得的啟動子PCgeAP利用限制性內(nèi)切酶Sac II和Nco I酶切后連接pUC-5.8SrDNA，得到載體 pUC_5.8S rDNA-PCgGAP ；(3)將PCR獲得的zeocin抗性基因利用限制性內(nèi)切酶Sal I和sph I酶切后連接于載體 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP,即得到載體 pURGAP ；3.以線性化的同源整合載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油假絲酵母，以zeocin抗性平板篩選陽性克隆子，并用PCR檢測轉(zhuǎn)化陽性克隆子。4.整合效果分析。對確認的陽性轉(zhuǎn)化子菌落進行計數(shù)，計算整合效率。與其它同源整合載體相比，以SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列構(gòu)建的整合載體pURGAP整合效率提高至其他方法的300%。5.本發(fā)明將構(gòu)建的整合載體應(yīng)用于外源基因在產(chǎn)甘油假絲酵母中的表達，表達載體pURGAP可效率高表達外源基因，能夠加快高表達重組菌株的獲得。通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)方案，實現(xiàn)以下有益效果:通過構(gòu)建含有特征5.8SrDNA序列SEQ N02的整合載體pURGAP，提高表達載體的整合效率，與其它同源整合載體相比以SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列構(gòu)建的整合載體pURGAP整合效率提高至其他方法的300%,并實現(xiàn)了外源基因在C.glycerolgenesis成功表達,為進一步改造重要的工業(yè)菌株Candida glycerolgenesis提供了一種有效的方法。
具體實施方案以下的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于下述的實施例。 本發(fā)明所使用的菌種:產(chǎn)甘油假絲酵母Candida glycerolgenesis CCTCC M93018、Ε.coliDH5a。實施例1:PCR擴增產(chǎn)甘油假絲酵母5.8S rDNA序列以引物rdnal、rdna2擴增產(chǎn)甘油假絲酵母5.8S序列:rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ;序列見 SEQ NOl。實施例2:重組整合表達載體pURGAP的構(gòu)建構(gòu)建的重組表達載體(pUC18作為基本骨架)參見附圖2:(I)將PCR獲得的特征5.8S rDNA經(jīng)Sac I和Hind III連到pUC18上，得到克隆載體 pUC-5.8S rDNA ；(2)將PCR獲得的啟動子PCgeAP利用限制性內(nèi)切酶Sac II和Nco I酶切后連接pUC-5.8SrDNA，得到載體 pUC_5.8S rDNA-PCgGAP ；(3)將PCR獲得的zeocin抗性基因利用限制性內(nèi)切酶Sal I和sph I酶切后連接于載體 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP,即得到載體 pURGAP ；實施例3:重組表達載體的轉(zhuǎn)化和篩選通過構(gòu)建的重組表達載體pURGAP重組質(zhì)粒用熱擊方法轉(zhuǎn)化E.coli DH5a擴增質(zhì)粒。提取質(zhì)粒，以HindIII線性化。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化C.glycerinogenes,以0.7M的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，涂布含有zeocin的YETO抗性再生平板(1M山梨醇為再生穩(wěn)定劑)。對轉(zhuǎn)化的陽性轉(zhuǎn)化子菌落計數(shù)，取三次重復的平均值，PURGAP的轉(zhuǎn)化效率可達到3X102cell/ng質(zhì)粒，而同樣條件下其它以非SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列構(gòu)建的整合載體轉(zhuǎn)化效率只能達到IX 102cell/ng質(zhì)粒，與其它同源整合載體相比以SEQ N03所示的特征5.8S rDNA序列構(gòu)建的整合載體整合效率提高至其他方法的300%。實施例4:誘導外源熒光蛋白在產(chǎn)甘油假絲酵母中表達利用熒光基因gfp構(gòu)建熒光蛋白表達載體pURGAP-gfp，構(gòu)建過程參見附圖3。所構(gòu)建載體 pURGAP-gfp 轉(zhuǎn)入宿主 Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018,從含 150ug/mLzeocin的YEH)從平板上挑取陽性克隆，利用PCR確定陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子接種于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)20h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接入IOmL含25%葡萄糖的YEPD液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200r/min。離心后獲得菌體。利用Olympus熒光顯微鏡對所獲得的菌體進行熒光分析?？梢钥吹骄G色熒光蛋白在宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018的高表達,與其它同源整合載體相比，以SEQ N02所示的特征 5.8S rDNA序列構(gòu)建的整合載體熒光蛋白表達強度增強明顯(圖4)。
序列表
SEQ N0.l:1GAAACTCCGT CGTGCTGGGG ATAGAGCATT GTAATTTTTG CTCTTCAACG AGGAATTCCT
61 AGTAAGCGCA AGTCATCAGC TTGCGTTGAT TACGTCCCTG CCCTTTGTAC ACACCGCCCG121 TCGCTACTAC CGATTGAATG GCTTAGTGAG GCTTCAAGAT TGGCGCCGCG GGAGGGGCAA181 CTTrTCCCATG GGGCCGAGAA TCTAGTCAAA CTTGGTCATT TAGAGGTCGT AAAAGTCGTA241 ACAAGGTTTC CGTAGGTGAA.CCTGCGGAAG GATCATTACT GTGATTTAGT ACTACACTGC301 GTGAGCGGAA CGAAAACAAA AACACCTAAA ATGTGGAATA TAGCATATAG TCGACAAGAG361 AAATCTACGA AAAACAAACA AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTC GCATCGATGA421 AGAGCGCAGC GAAATGCGAT ACCTAGTGTG AATTGCAGCC ATCGTGAATC ATCGAGTTCC481 TGAACGCACA TTGCGCCCCT CGGCATTCCG GGGGGCATGC CTGTTTGAGC GTCGTTTCCA541 TCTTGCGCGT GCGCAGAGTT GGGGGAGCGG AGCGGACGAC GTGTAAAGAG CGTCGGAGCT601 GCGACTCGCC TGAAAGGGAG CGAAGCTGGC CGAGCGAACT AGACTTTTTT TCAGGGACGC661 TTGGCGGCCG AGAGCGAGTG TTGCGAGACA ACAAAAAGCT CGACCTCAAA TCAGGTAGGA721 ATACCCGCTG AACTTAAGCA
SEQ N0.2:
上游同源臂:
1GAAACTCCGT CGTGCTGGGG ATAGAGCATT GTAATTTTTG CTCTTCAACG AGGAATTCCT
61 AGTAAGCGCA AGTCATCAGC TTGCGTTGAT TACGTCCCTG CCCTTTGTAC ACACCGCCCG121 TCGCTACTAC CGATTGAATG GCTTAGTGAG GCTTCAAGAT TGGCGCCGC
下游同源臂:
C CTGTTTGAGC GTCGTTTCCA
541 TCTTGCGCGT GCGCAGAGTT GGGGGAGCGG AGCGGACGAC GTGTAAAGAG CGTCGGAGCT601 GCGACTCGCC TGAAAGGGAG CGAAGCTGGC CGAGCGAACT AGACTTTTTT TCAGGGACGC661 TTGGCGGCCG AGAGCGAGTG TTGCGAGACA ACAAAAAGCT CGACCTCAAA TCAGGTAGGA721 ATACCCGCTG AACTTAAGCA
權(quán)利要求
1.一種重組表達載體pURGAP的構(gòu)建，其特征在于一種能利用同源重組表達外源基因的產(chǎn)甘油假絲酵母整合載體如附圖1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)甘油假絲酵母整合載體以特征5.8S rDNA序列SEQ NOl為整合位點ο引物rdnal、rdna2擴增5.8S序列:rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG0 以特征5.8S rDNA序列SEQ N02作為同源整合臂，可提高整合載體的轉(zhuǎn)化效率和表達強度。
3.如權(quán)利要求1所述所構(gòu)建的pURGAP載體，其特征在于包含有滲透壓啟動子PegeAP、zeocin抗性標記和在大腸桿菌高拷貝的所有元件。
4.權(quán)利要求1所述的整合載體特征是包含滲透調(diào)控的重組整合表達載體、克隆載體及穿梭載體。
5.權(quán)利要求1所述載體應(yīng)用于滲透壓調(diào)控外源基因表達、功能基因的穩(wěn)定表達或過表達功能基因的篩選及鑒定。 應(yīng)用于產(chǎn)甘油假絲酵母高代謝工程改造。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能用同源重組來克隆的產(chǎn)甘油假絲酵母整合載體pURGAP的構(gòu)建及其應(yīng)用。所構(gòu)建的pURGAP載體包含有酵母Candida glycerinogenes的通過構(gòu)建帶有5.8S rDNA序列SEQ NO.2，可整合于酵母Candida glycerinogenes特征5.8S序列SEQ NO.1位點，所構(gòu)建的pURGAP載體還包含有滲透壓啟動子PCgGAP、zeocin抗性標記和在大腸桿菌高拷貝的所有元件。與其它整合載體相比，pURGAP以特征5.8S rDNA序列為整合位點可顯著提高整合載體轉(zhuǎn)化效率，并明顯增強外源蛋白表達強度。所構(gòu)建的pURGAP可有效地將外源基因或啟動子在產(chǎn)甘油假絲酵母中進行整合表達，是提高表達載體的整合效率，加速工業(yè)菌株產(chǎn)甘油假絲酵母重組改造速度的一種重要方法。
文檔編號C12N1/19GK103173483SQ20121057874
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者諸葛斌, 張 成, 方慧英, 諸葛健, 宗紅 申請人:江南大學