專利名稱：四種菌的三重實時熒光pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、丙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和雞傷寒沙門氏菌(Salmonella gal I inarum)的三重實時突光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科，是人類重要的腸道致病菌，也可在動物腸道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙門氏菌有2500多個血清型，我國發現了 200多個血清型。沙門氏菌所致的疾病主要有兩大類。一類是傷寒和副傷寒，由傷寒或副傷寒沙門氏菌引起，偶見由其他沙門氏菌引起傷寒樣的感染，如豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等。雞傷寒沙門氏菌(Salmonella gal I inarum)是雞的重要致病菌,主要引起雞傷寒(fowl typhoid)。食品中沙門氏菌的檢測主要是依靠傳統的培養的方法，該方法需選擇性增菌培養、生化鑒定、血清分型，通常要5-6天才能得出檢測結果，不利于及時診斷、查找病源，控制病情的蔓延。沙門氏菌的傳統方法鑒定需要經過病原的初步分離、生化鑒定并結合血清學分型，然后不同血清型之間發生的交叉反應會干擾血清學診斷的準確性。如腸炎沙門氏菌菌毛蛋白在沙門氏菌D群血清 型中仍有編碼。用該菌毛蛋白進行的凝集試驗常與雞傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌等發生交叉凝集，即使是應用SEF14菌毛抗原制成的純化單克隆抗體進行膠乳凝集試驗，仍與都柏林沙門氏菌發生交叉反應，從而使傳統的檢測方法中存在一定比例的假陽性等問題。隨著分子生物學技術的發展，已有針對irwA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEF14、sefA、sdf、ssaQ、fimY 等為目標基因，用普通 PCR 或實時突光PCR檢測沙門氏菌的報道，但以上述序列作為目的片段的PCR法，只能檢測到一部分Sa血清型或其毒力基因，不能同時得出所檢測沙門氏菌屬的血清型、毒素分泌類型等。目前也有商業化的杜邦公司生產的Bax系統，該系統利用熒光PCR技術從屬的水平上檢測沙門氏菌，具有較高的特異性，但不能對沙門氏菌進行分型。為目的基因設計引物，建立了多重PCR檢測沙門氏菌(Salmonella spp)、SE (Enteritidis)、傷寒Sa (Typhi)、ST (Typhimurium)的方法,應用于雞肉中的沙門氏菌檢測，KIM等也根據鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌的特異序列設計多對弓丨物，建立了多重PCR檢測鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌的方法，均得到較好的效果，但上述方法需通過凝膠電泳判定結果，操作較為繁瑣。EdelO’Regan等用flic、sefA、sdf、acek基因設計引物探針，用多重熒光PCR方法檢測 Enteritidis, Gallinarum, Typhimurium, Kentucky 和 Dublin 沙門氏菌，但 sefA 為目的基因無法準確區分Enteritidis, Gallinarum和Dublin, flic為目的片段則無法區分Typhimurium和Kentucky，DavidFde等用普通PCR和應該光PCR來檢測豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，但該研究也未對熒光PCR擴增體系的擴增效率等進行系統的評價。因此，建立快速檢測豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞沙門氏菌的方法，對于食品中沙門氏菌的檢測、預防與控制具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、快速、可靠、靈敏度高、特異性強的豬霍亂沙門氏菌(SC)、丙型副傷寒沙門氏菌(SP)、傷寒沙門氏菌(ST)、雞傷寒沙門氏菌(SG)三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法，通過一次實時熒光PCR擴增就能判斷樣品是否受到豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的污染，再通過單一熒光PCR擴增區分豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌。本發明用豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列(GenBank AE017220.1)、傷寒沙門氏菌的特異序列(GenBank NC_016832.1 )、雞傷寒沙門氏菌的特異序列(GenBank:HQ703462)、豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列(GenBank CP000857)分別設計檢測引物和檢測探針，豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列用于檢測豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，傷寒沙門氏菌的特異序列用于檢測傷寒沙門氏菌，雞傷寒沙門氏菌的特異序列用于檢測雞傷寒沙門氏菌，豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列用于區分豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，利用基于Taqman探針的三重實時熒光PCR方法，通過一次實時熒光PCR擴增來判斷樣品中是否受到豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌的污染，再通過單一實時熒光PCR擴增區分豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，達到簡便、快速、可靠、靈敏度高和特異性強的目的，從而實現了本發明的目的。本發明的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述的檢測弓I物如下所示針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GG TGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示) 針對傷寒沙門氏菌特異序列STF 5' -GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)針對雞傷寒沙門氏菌特異序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)。本發明的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列的探針SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)傷寒沙門氏菌特異序列的探針STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)
雞傷寒沙門氏菌特異序列的探針SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的探針SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團，四個探針的5'端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。所述的熒光報告基因優選為FAM、HEX、TET或R0X，所述的熒光淬滅基團優選為TAMARA 或 BHQI。本發明的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光PCR反應液、UNG酶、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物包括四對(I)針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列SCF 5' -GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ;(如 SEQ ID NO.1 所示)SCR 5' -GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2 )傷寒沙門氏菌特異序列STF 5' -GTGG CTATGCAGTGAAAATGG-3' ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)STR 5' -CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)(3 )雞傷寒沙門氏菌特異序列SGF :5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)SGR :5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3'。(如 SEQ ID NO. 6 所示)(4)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列SPF 5' -AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)SPR 5' -TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ；(如 SEQ ID NO. 8 所示)所述的檢測探針包括(I)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列的探針SCP 5' -AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)(2 )傷寒沙門氏菌特異序列的探針STP 5' -ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ;(如 SEQ ID NO. 10 所示)(3 )雞傷寒沙門氏菌特異序列的探針SGP 5' -ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ;(如 SEQ ID NO. 11 所示)(4)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的探針SPP 5' -AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ;(如 SEQ ID NO. 12 所示)探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團，四個探針的5'端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。本發明的非疾病的診斷和治療目的的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列、傷寒沙門氏菌特異序列和雞傷寒沙門氏菌特異序列的檢測引物及檢測探針，與實時熒光PCR擴增用的反應液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系；(3)將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應，反應結束后，根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)；(4)根據各樣品的Ct值，按照建立的標準曲線，判斷樣品中是否含有豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌；(5)上述步驟(4)得出的樣品檢測結果中如果擴增出豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，則以步驟(I)所提取的增菌液中菌體的基因組DNA作為模板，使用上述針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的檢測引物和檢測探針，與實時熒光PCR擴增用的反應液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系，將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行單一實時熒光PCR反應，反應結束后，根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)，根據各樣品的Ct值，按照建立的標準曲線，區分樣品中的豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌。所述的樣品優選為食品。所述的步驟(2)的擴增反應體系優選為模版DNA3 U L，IOXTaqMan緩沖液4 yl，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三種 20 y mol/L 檢測探針 SCP，STP 和 SGP 各Iil 1，共 1，六條 20iimol/L 檢測引物 SCF、SCR、STF、STR、SGF 和 SGR 各 I y 1，共 6 y 1，0.55U UNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/U I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 5.1。所述步驟(3)的進行實時熒光PCR反應，其反應參數優選為95°C 30s、95°C 5s、60°C 34s、40個循環。結果判斷標準以熒光PCR檢測擴增曲線指數期明顯，且Ct〈37為陽件判定原則，如果擴增曲線指數期明顯且Ct〈35可直接判定為陽性，如果Ct值在35 37之間判斷為可疑，需要加大模板量進行重復實驗，若出現指數期明顯的擴增曲線方可判定為陽性，否則為陰性。所述步驟(5)的擴增反應體系優選為模版DNAlii L，10 X TaqMan緩沖液4 iil，5mmol/LMgCl22u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，20 y mol/L針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的檢測探針SPP和檢測引物SPF、SPR各liil，0. 55U UNG酶0. 2iU，
2.5U/ U I Taq聚合酶3 U I,去離子水13. 8 U I。所述步驟(5)的進行單一實時熒光PCR反應，其反應參數優選為95°C 30s、95°C 5s,60°C 34s、40個循環。結果判斷標準以熒光PCR檢測擴增曲線指數期明顯，且Ct〈37為陽件判定原則，如果擴增曲線指數期明顯且Ct〈35可直接判定為陽性，如果Ct值在35 37之間判斷為可疑，需要加大模板量進行重復實驗，若出現指數期明顯的擴增曲線方可判定為陽性，否則為陰性。本發明根據豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列(GenBank: AEO17220.1 )、傷寒沙門氏菌的特異序列(GenBank: NC_016832.1)、雞傷寒沙門氏菌的特異序列(GenBank: HQ703462 )、霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列(GenBank:CP000857)分別設計檢測引物和檢測探針，利用該檢測引物和檢測探針按照本發明的方法對樣品進行三重實時熒光PCR檢測，用豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列檢測豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷 寒沙門氏菌，用傷寒沙門氏菌的特異序列檢測傷寒沙門氏菌，用雞傷寒沙門氏菌的特異序列檢測雞傷寒沙門氏菌，在一次實時熒光PCR擴增反應中完成對豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的檢測，再通過單一實時熒光PCR擴增區分豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，從而簡便、快速、可靠地判斷樣品是否受到豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的污染。以本發明的檢測引物及檢測探針按照本發明的方法對樣品進行三重實時熒光PCR檢測，檢測快速，可在31h完成從制備樣品到出具檢測結果的過程，不受假陽性和交叉污染等干擾，結果可靠，且靈敏度高、特異性強，為沙門氏菌進行流行病學調查提供了有利工具。適用于食品的檢驗檢疫，可供檢驗檢疫局、疾病預防控制中心和質量監督部門對樣品進行簡便、快速、準確的檢測。


圖1是豬霍亂沙門氏菌特異性試驗熒光PCR擴增圖；圖2是丙型副傷寒沙門氏菌特異性試驗熒光PCR擴增圖；圖3是傷寒沙門氏菌特異性試驗熒光PCR擴增圖；圖4是雞傷寒沙門氏菌特異性試驗熒光PCR擴增圖；圖5是區別丙型副傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌熒光PCR擴增圖；圖6是豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌梯度稀釋三重熒光PCR擴增圖，其中，紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；圖7是丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌梯度稀釋三重熒光PCR擴增圖，其中，紅色為FAM，綠色為H EX，藍色為TET ；圖8是添加豬霍亂沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖；圖9是添加丙型副傷寒沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖；圖10是添加傷寒沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖；圖11是添加雞傷寒沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖；圖12是添加豬霍亂沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖；圖13是添加丙型副傷寒沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖；圖14是添加傷寒沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖；圖15是添加雞傷寒沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖；圖16是添加豬霍亂沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖；圖17是添加丙型副傷寒沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖；圖18是添加傷寒沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖；圖19是添加雞傷寒沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖；圖20是污染了豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；圖21是污染了豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；圖22是污染了豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；圖23是污染了丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的豬肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；
圖24是污染了丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的雞肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX ；圖25是污染了丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌的魚肉樣品熒光PCR擴增圖，其中紅色為FAM，綠色為TET，黃色為HEX。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1菌株的選取及檢測引物、檢測探針的設計選取34種不同血清型沙門氏菌共142株，包括丙型副傷寒沙門氏菌標準菌株I株(IQCC10527 )、丙型副傷寒沙門氏菌分離株21株(SP1-SP21)、豬霍亂沙門氏菌標準菌株I株(IQCC10502)、豬霍亂沙門氏菌分離株24株(SC1-SC24)、傷寒沙門氏菌標準菌株I株(CMCC50071)、傷寒沙門氏菌分離株30株(ST1-ST30 )、雞傷寒沙門氏菌標準菌株I株(CMCC50770)、雞傷寒沙門氏菌分離株33株(SG1-SG33)、30株其他血清型沙門氏菌，除此之外選取變形桿菌等21株非沙門氏菌，菌株信息如表I所示。上述菌株均經API20E試劑條和血清學試驗進行確證。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、廣東省疾病預防控制中心、中國檢驗檢疫科學研究院、廣東出入境檢驗檢疫局技術中心。

表I實驗用菌株信息表
權利要求
1.一種豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示 針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； 針對傷寒沙門氏菌特異序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； 針對雞傷寒沙門氏菌特異序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； 針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3,；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3'。
2.一種豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示 豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列的探針SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； 傷寒沙門氏菌特異序列的探針STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； 雞傷寒沙門氏菌特異序列的探針SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； 豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的探針 SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團，四個探針的5'端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。
3.根據權利要求2所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的熒光報告基因為FAM、HEX、TET或ROX，所述的熒光淬滅基團為TAMARA或BHQl。
4.一種豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光PCR反應液、UNG酶、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物包括四對 (1)針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列SCF 5'-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3' ；SCR 5'-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3' ； (2)傷寒沙門氏菌特異序列STF 5'-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3' ；STR 5'-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3' ； (3)雞傷寒沙門氏菌特異序列SGF 5'-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3' ；SGR 5'-TCATGCACTACCACCATAACG-3' ； (4)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列SPF 5'-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3' ；SPR 5'-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3' ； 所述的檢測探針包括 (I)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列的探針SCP 5'-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3' ； (2 )傷寒沙門氏菌特異序列的探針STP 5'-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3' ； (3 )雞傷寒沙門氏菌特異序列的探針SGP 5'-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3' ； (4)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的探針SPP 5'-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3' ； 探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團，三探針的5'端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。
5.一種非疾病的診斷和治療目的的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權利要求1所述的針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的共有序列、傷寒沙門氏菌特異序列和雞傷寒沙門氏菌特異序列的檢測引物及權利要求2所述的檢測探針SCP、STP、SGP，與實時熒光PCR擴增用的反應液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系； (3)將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應，反應結束后，根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)； (4)根據各樣品的Ct值，按照建立的標準曲線，判斷樣品中是否含有豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌； (5)上述步驟(4)得出的樣品檢測結果中如果擴增出豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，則以步驟(I)所提取的增菌液中菌體的基因組DNA作為模板，使用權利要求1所述的針對豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的差異序列的檢測引物和權利要求2所述的檢測探針SPP，與實時熒光PCR擴增用的反應液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系，將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行單一實時熒光PCR反應，反應結束后,根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)，根據各樣品的Ct值，按照建立的標準曲線，區分樣品中的豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌。
6.根據權利要求5所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的樣品為食品。
7.根據權利要求5所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)的擴增反應體系為模版0嫩31^，10\1&9]\&111緩沖液411 l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u 1，三種20iimol/L權利要求2所述的檢測探針SCP，STP和SGP各lyl，共3^1，六條20iimol/L權利要求1所述的檢測引物SCF、SCR、STF、STR、SGF和SGR各I yl，共6 yl，0. 55U UNG酶0. 2u 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 5. 8yl。
8.根據權利要求5所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)的進行實時熒光PCR反應,其反應參數為95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40個循環。
9.根據權利要求5所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(5)的擴增反應體系為模版DNAl ii L，10XTaqMan 緩沖液4 ii l,5mmol/L MgCl22 u 1,2. 5mmol/L dNTPs3 u l,20umol/L權利要求2所述的檢測探針SPPl u I，權利要求1所述的檢測引物SPF、SPR各I iil，0. 55UUNG 酶 0.2 ii 1,2. 5U/u I Taq 聚合酶 3 ii 1，去離子水 13.8ii I。
10.根據權利要求5所述的豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(5)的進行單一實時熒光PCR反應，其反應參數為95°C 30s,95°C 5s,60°C 34s,40個循環。
全文摘要
本發明公開了一種豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。本發明利用三重實時熒光PCR方法，將豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌共有序列用于檢測豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌，傷寒沙門氏菌的特異序列用于檢測傷寒沙門氏菌，雞傷寒沙門氏菌的特異序列用于檢測雞傷寒沙門氏菌，通過一次實時熒光PCR擴增來判斷樣品中是否受到豬霍亂沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌的污染，再通過單一熒光PCR擴增區分豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌，檢測快速，可在31h完成從制備樣品到出具檢測結果的過程，結果可靠，且靈敏度高、特異性強。
文檔編號C12N15/11GK103060447SQ201210581310
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 柯碧霞, 相大鵬, 柯昌文 申請人:許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 柯碧霞, 相大鵬, 柯昌文