專(zhuān)利名稱(chēng)：一種乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)方法，尤其涉及一種植物乳桿菌或干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌條件優(yōu)化的混合培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微生態(tài)制劑是指被添加到飼料中的一種重要腸道菌群調(diào)節(jié)劑，又稱(chēng)益生菌劑，具有調(diào)整腸道菌群平衡、促進(jìn)機(jī)體免疫、改善飼料適口性、提高飼料利用率、增強(qiáng)動(dòng)物抗病能力等作用，作為飼料添加抗生素的替代品已得到養(yǎng)殖業(yè)的認(rèn)可。1989年美國(guó)食品藥物管理局(FAD)和美國(guó)飼料公協(xié)會(huì)(AAFCO)公布了 44種可直接飼喂且通常認(rèn)為是安全的微生物作為微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌株，其中包括28種乳酸菌、2種芽孢菌、2種酵母菌和2種曲霉。2008年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部1126號(hào)公告規(guī)定的可直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑共16種，如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、沼澤紅假單胞菌、釀酒酵母、產(chǎn)穌假絲酵母。微生態(tài)制劑通常由多種微生物組成，是一種混合活菌制劑。目前應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的微生態(tài)制劑主要是乳酸菌和芽孢桿菌。乳酸菌為兼性厭氧菌、芽孢桿菌為好氧菌，并且兩者的生長(zhǎng)特性及營(yíng)養(yǎng)要求差異很大，傳統(tǒng)的工業(yè)發(fā)酵中通常采用單獨(dú)培養(yǎng)、然后再混合的生產(chǎn)工藝，由此導(dǎo)致設(shè)備利用率低，生產(chǎn)成本增加。研究表明，飼喂芽孢菌的動(dòng)物，其腸道及糞便中乳酸菌數(shù)量增加，說(shuō)明芽孢菌對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；目前有報(bào)道，有些乳桿菌在有氧條件下生物量提高，在有血紅素等物質(zhì)存在下，可激活其過(guò)氧化氫酶，降低氧脅迫，菌體存活性延長(zhǎng)。枯草芽孢桿菌為好氧菌，能產(chǎn)生多種過(guò)氧化物酶，對(duì)氧脅迫有完善的防御機(jī)制。基于此理論，研發(fā)植物乳桿菌或干酪乳桿菌與枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)的優(yōu)化工藝條件，為微生態(tài)制劑的混合菌群發(fā)酵提供參考具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種植物乳桿菌或干酪乳桿菌與枯草芽孢桿菌條件優(yōu)化的混合培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，步驟是(I)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的植物乳桿菌或干酪乳桿菌菌株分別接種到MRS培養(yǎng)基中，37± 1°C靜止培養(yǎng)12±2小時(shí)；(2)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37±l°C、220rpm震蕩培養(yǎng)12±2小時(shí)；(3)將步驟(1)制得的植物乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1% 10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37土 rc、220rpm震蕩培養(yǎng)18±1小時(shí)收獲；或?qū)⒉襟E(I)制得的干酪乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1. 5% 10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37± 1°C、220rpm震蕩培養(yǎng)24 ± I小時(shí)收獲。
上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中所述植物乳桿菌優(yōu)選植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum) CGMCC No. 6888 ;所述干釀乳桿菌優(yōu)選干釀乳桿菌(Lb. casei )ATCC393(pL251);所述枯草芽孢桿菌優(yōu)選 B. subtilis ATCC23857。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述MRS培養(yǎng)基的配方如下
蛋白胨10.0 g
牛肉膏10.0 g
酵母膏5.0 g
檸檬酸氫二銨[(NH4) ,HC6H5O7]2.0 g
葡萄糖(C6H12CVH2O)20.0 g
吐溫 80l.OmL
乙酸鈉(CH3C00Na.3H20)5.0 g
磷酸氫二鉀(Κ2ΗΡ04·3Η20 )2.0 g
硫酸鎂(MgSCMTH2O )0.58 g
硫酸錳(MnSCMH2O)0.25 g
蒸餾水I 000 mL
pH6.2-6.6121°C條件下滅菌15分鐘。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述LB培養(yǎng)基的配方是蛋白胨lg，酵母提取物 O. 5g，NaCl lg，瓊脂1. 5_2g，水 100ml。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述MRS-Ca培養(yǎng)基的配方是在MRS培養(yǎng)基上，加入終重量百分比濃度為O. 02%的CaCl2。一種應(yīng)用于上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法的植物乳桿菌，所述菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) K2,分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，申請(qǐng)人已于2012年11月27日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No. 6888。本發(fā)明公開(kāi)了一種乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，特別適合于微生態(tài)制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明顯著的優(yōu)點(diǎn)是將乳酸桿菌和芽孢桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵，充分發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用，對(duì)乳酸菌的有氧代謝提供保護(hù)，提高了設(shè)備利用率。


圖1所示，Lb. plantarum CGMCC6888和B. subtilis ATCC23857、Lb. casei ATCC393(pL215)和 B. subtilis ATCC23857 分別按照 1%+10% 和1. 5%+10% 接種比例接種于 MRS-Ca培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并與單獨(dú)菌株培養(yǎng)時(shí)做比較。其中B.subtilis ATCC23857 與 Lb. plantarum CGMCC6888 混合培養(yǎng)(■)、B. subtilis ATCC23857 與 Lb. casei ATCC393 (pL215)混合培養(yǎng)(▲)、B. subtilisATCC23857 單獨(dú)培養(yǎng)(·)、Lb. plantarum CGMCC6888 單獨(dú)培養(yǎng)(□)、Lb. casei ATCC393(PL215)單獨(dú)培養(yǎng)(Λ)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
圖 2Lb. plantarum CGMCC6888 和 B. subtilis ATCC23857、Lb. casei ATCC393(pL215)和B. subtilis ATCC23857按照附圖1的比例接種于MRS-Ca培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)12h、18h和24h時(shí)，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)。其中(a)Lb. plantarum CGMCC6888 或 Lb. caseiATCC393 (pL215)活菌數(shù)；(b)
B.subtilis ATCC23857 總菌數(shù);(c) B. subtilis ATCC23857 芽孢數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :混合培養(yǎng)接種條件的優(yōu)化為使兩種菌生長(zhǎng)在同一體系中時(shí)具有基本一致的生長(zhǎng)速率，兩種菌混合前種子的生長(zhǎng)狀態(tài)、混合時(shí)的接種量和接種比例非常重要。本發(fā)明首先將種子活化至對(duì)數(shù)期后期至穩(wěn)定期前期，方法是(I)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No. 6888 或干酪乳桿菌(Lb. casei) ATCC393 (pL215)菌株分別接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12小時(shí)；(2)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌(B. subtilis)ATCC23857菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)；然后將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC No. 6888 或干釀乳桿菌(Lb. casei)ATCC393(pL215)與(B. subtilis) ATCC23857 先按重量比 1%+20%、2%+20%、1%+10%、1%+5% 接種量混合于20mL MRS-Ca培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)18h 24h，測(cè)定培養(yǎng)接的吸光度(0D600nm),結(jié)果確定最佳的混合條件(以重量百分比計(jì))為1%植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) CGMCCNo. 6888+10% 枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC23857,或1. 5% 干酪乳桿菌(Lb. casei )ATCC393 (pL215)+10% 枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC23857 生物量最高。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述MRS培養(yǎng)基的配方如下
蛋白胨10.0 g
牛肉膏10.0 g
酵母膏5.0 g
檸檬酸氫二銨[(NH4) 2HC6H507]2.0 g
葡萄糖(C6H12(VH2O)20 Og
Iihiffii 801.0 mL
乙酸鈉(CHiCOONaeH2O)5.0 g
磷酸氫二鉀(K2HP04.3H20)2.0 g
硫酸鎂 CMgS04*7H20)0.58 g
硫酸錳(MnSO4^H2O)0.25 g
蒸餾水IOOOmL
pH6.2~6.6121°C條件下滅菌15分鐘。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述LB培養(yǎng)基的配方是蛋白胨lg，酵母提取物 O. 5g，NaCl lg，瓊脂1. 5_2g，水 100ml。上述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法中，所述MRS-Ca培養(yǎng)基的配方是在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，加入終重量百分比濃度為O. 02%的CaCl2。上述植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) CGMCC No. 6888,分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，申請(qǐng)人已于2012年11月27日保藏到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，上述干酪乳桿菌(Lb. casei) ATCC393 (pL215)與枯草芽孢桿菌(B. subtilis)ATCC23857均購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心。實(shí)施例2 混合培養(yǎng)物最佳收獲時(shí)間的確定乳桿菌的活菌數(shù)、芽孢桿菌的芽孢數(shù)是衡量微生態(tài)制劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。按照實(shí)施例1最佳接種比例，即以重量比計(jì)，將1%植物乳桿菌(Lb. plantarum) CGMCC No. 6888+10%枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC23857，或1. 5% 干酪乳桿菌(Lb. casei )ATCC393 (pL215)+10%枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC23857接種于20mL MRS-Ca培養(yǎng)基后，37°C、220rpm震蕩
培養(yǎng)，分別于12h、18h、24h取樣測(cè)定乳桿菌活菌數(shù)、芽孢桿菌總菌數(shù)及芽孢數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于有氧代謝時(shí)遭受氧脅迫較輕的Lb. casei ATCC393 (pL215)，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至24h時(shí)對(duì)于其活菌數(shù)無(wú)明顯影響，并可獲得更高的芽孢數(shù)。對(duì)于有氧代謝時(shí)產(chǎn)生大量H2O2的植物乳桿菌(Lb. plantarum) CGMCC No. 6888，雖然混合培養(yǎng)物中B. subtilisATCC23857可以清除環(huán)境中H2O2 (未檢測(cè)到H2O2的積累)，其活菌數(shù)還是因?yàn)橐欢ǔ潭鹊难趺{迫，在18h后開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，因此培養(yǎng)時(shí)間不能再延長(zhǎng)，收獲時(shí)間是18h。綜合以上數(shù)據(jù)，對(duì)于Lb. caseiATCC393 (pL215)和 B. subtilis ACTT23857 的混合培養(yǎng)，較優(yōu)的接種量為1. 5%+10%，收獲時(shí)間為24h ;對(duì)于Lb. plantarum CGMCC6888和
B.subtilis ATCC23857的混合培養(yǎng)，較優(yōu)的接種量為1%+10%，收獲時(shí)間為18h。實(shí)施例3 :優(yōu)選乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)方法(I)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的植物乳桿菌(Lb. plantarum) CGMCC6888或干酪乳桿菌(Lb. casei )ATCC393(pL215)菌株分別接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12小時(shí)；(2)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ATCC23857菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)；(3)將步驟(I)制得的植物乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1% 10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)18小時(shí)收獲；或?qū)⒉襟E(I)制得的干酪乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1. 5% 10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37°C、220rpm震蕩培養(yǎng)24小時(shí)收獲。上述實(shí)施例中所用MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、MRS-Ca培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，步驟是(1)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的植物乳桿菌或干酪乳桿菌菌株分別接種到MRS培養(yǎng)基中，37± I°C靜止培養(yǎng)12±2小時(shí)；(2)取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37±1°C、 220rpm震蕩培養(yǎng)12±2小時(shí)；(3)將步驟(I)制得的植物乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1% 10%的混合接種比例接種在11 -0&培養(yǎng)基中，37±11、220印111震蕩培養(yǎng)18±1小時(shí)收獲；或?qū)⒉襟E(I)制得的干酪乳桿菌與步驟(2)制得的枯草芽孢桿按重量比1. 5% 10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37±1°〇、220印111震蕩培養(yǎng)24 ± I小時(shí)收獲。
2.如權(quán)利要求1所述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，其特征在于所述植物乳桿菌選植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum) CGMCC No. 6888 ;所述干釀乳桿菌選干釀乳桿菌(Lb. casei) ATCC393(pL215);所述枯草芽孢桿菌選 B. subtilis ATCC23857。
3.如權(quán)利要求1所述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，其特征在于所述MRS-Ca 培養(yǎng)基的配方是在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入終重量百分比濃度為O. 02%的CaCl2。
4.一種應(yīng)用于權(quán)利要求1所述乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法的植物乳桿菌， 其特征在于所述菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) K2,已于2012年 11月27日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC No.6888。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乳酸桿菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的方法，是將植物乳桿菌與枯草芽孢桿按重量比1%﹕10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)18小時(shí)收獲；或?qū)⒏衫胰闂U菌與枯草芽孢桿按重量比1.5%﹕10%的混合接種比例接種在MRS-Ca培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)24小時(shí)收獲。本發(fā)明特別適合于微生態(tài)制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)，其顯著的優(yōu)點(diǎn)是將乳酸桿菌和芽孢桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵，充分發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用，對(duì)乳酸菌的有氧代謝提供保護(hù)，提高了設(shè)備利用率。
文檔編號(hào)C12R1/125GK103013890SQ201210581009
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者孔健, 劉陶陶, 孔文濤, 張莉, 付龍?jiān)? 季明杰 申請(qǐng)人:山東大學(xué)