專利名稱：宏基因組提取方法
技術領域：
本發明涉及提取宏基因組的方法，具體地涉及降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的方法。
背景技術：
宏基因組是出現在某一環境樣品中的所有遺傳物質，包括許多個體物種的基因組。宏基因組學是指直接從環境樣品中獲得遺傳物質，對宏基因組進行研究的科學。隨著高通量DNA測序和生物信息學的發展，宏基因組學的應用價值不斷提升。通過分析宏基因組文庫，可發現某環境中微生物的群體特征及相互作用規律，探討微生物與環境的相互影響。對微生物群體DNA的測序，可篩選具有特定功能的基因，獲得特殊功能的蛋白。人呼吸道每天接觸到大量的病毒和細菌等微生物，對呼吸道宏基因組的研究能有效地了解各微生物群體的特征，從而幫助臨床診斷和治療。在呼吸道宏基因組中，相對于宿主人的基因組含量，病原體基因組含量一般比較小。因此，在呼吸道宏基因組測序中，為達到病原體基因組足夠的序列覆蓋度，消除宿主基因組的影響是非常重要的。人呼吸道樣品中總DNA的質量是宏基因組測序成功與否的關鍵。對傳染病樣品，處理DNA污染的方法需要花費比較多的時間，或者收集樣品時需要特殊的處理方法。一般提取DNA時，需要利用去垢劑SDS或者溶菌酶、蛋白酶K等裂解細胞，然后利用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀DNA。在提取宏基因組DNA時，由于細胞類型的多樣性以及存在宿主DNA的干擾，所以需要更有效的純化方法用于DNA的提取。人Alu 重復序列屬于短散在序列(short interspersed elements, SINEs)家族。每個Alu序列的長度約280bp，具有可變的多聚A(poly-A)尾巴。Alu重復序列超過一百萬條，約占人基因組的10%，已經被用于人類某些遺傳疾病的分析。Alu重復序列是不同的，可被分為幾個亞家族，是極好的標志物，可被用于檢測人類基因組。Alu作為特異的探針，使用PCR技術，可以定量人基因組DNA。在人類基因組中，許多新的Alu序列被發現，并且大部分序列在其他靈長類基因組中不存在，因此依據特異Alu重復序列的分析可作為人類DNA鑒定和定量的有利方法。鏈霉親和素包被的磁珠，目前已經廣泛應用于生物素化核酸、抗體或其他生物素化配體及靶分子分離和處理。直徑為2. 8 μ m的超順磁珠，具有共價連接到表面并另外用BSA封閉的單層重組鏈霉親和素。由于具有單層的鏈霉親和素，絕大多數生物素結合位點在空間上不僅可以結合游離生物素，而且還可以結合生物素化的配體。它們顯示出快速液相反應動力學特性，并且形狀確定的特異性表面便于進行高效捕獲、分離和下游操作。實時突光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction,簡稱 Real-timePCR,也被稱為 quantitative Real-time polymerase chain reaction,簡稱 Q-PCR),是基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,簡稱PCR)的分子生物學技術,該技術可以對目標片段進行擴增的同時對目標DNA分子進行定量分析。實時熒光定量PCR使用特異的探針序列或者引物，隨著擴增過程中DNA模板量的增加，釋放出的熒光強度也在增加，因此實時熒光定量PCR可以利用較少的樣品，動態檢測初始目標DNA的含量。

發明內容
本發明目的在于提供一種提取人類宏基因組的方法，該方法利用探針雜交消減法，能夠有效降低宿主宏基因組中宿主DNA背景干擾。本發明第一方面，提供了一種宏基因組提取方法，其特征在于利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的影響。根據本發明的實施方式，所述探針與所述宿主基因組DNA樣品雜交后與所述磁珠偶聯。根據本發明的實施方式，提供了一種宏基因組提取方法，包括步驟
1)將標記有生物素的所述探針與提取的所述宿主宏基因組DNA樣品進行雜交；
2)用包被有鏈霉親和素的所述磁珠捕獲探針與所述宿主DNA的復合體，并用磁力架分離磁珠-探針-目標DNA復合物；
3)將去除所述磁珠-探針-目標DNA復合物的雜交液以及雜交后的磁珠清洗液進行純化回收DNA。根據本發明的實施方式，所述探針與所述磁珠偶聯后與所述宿主基因組的雜交。根據本發明的另一個實施方式，提供了一種宏基因組提取方法，包括步驟
1)利用包被有鏈霉親和素的所述磁珠與標記生物素的所述探針偶聯；
2)將偶聯好的復合物與所述宿主宏基因組DNA樣品雜交；
3)去除磁珠-探針-目標DNA復合物，對雜交液和雜交清洗液進行純化回收DNA。根據本發明的實施方式，所述的宏基因組提取方法中，在偶聯溫度下使用多種正反向探針。使用多種正反向探針，可擴大探針與宿主DNA雜交時結合的范圍，同時可以充分飽和磁珠上的鏈霉親和素位點，提高磁珠的利用效率。根據本發明的實施方式，所述的宏基因組提取方法中，在雜交完成之后，對所述磁珠-探針-DNA復合物進行加熱或者氫氧化鈉法變性，回收偶聯有探針的磁珠。回收回收偶聯有探針的磁珠，可降低實驗成本。根據本發明的實施方式，針對人基因組Alu重復序列家族設計探針，通過這些探針雜交消減，達到減少人體DNA在樣品中比例的目的。其中探針以多種Alu重復序列家族以及其兩端的保守序列為模板，雙向設計探針，探針長度在4(T70nt之間，且5’端修飾有生物素。探針序列可選自序列表SEQ ID NO:1 139的人Alu序列。利用人特異的Alu序列，消除呼吸道樣品中宿主人基因組的影響，對高通量宏基因組測序有非常顯著的幫助。本發明第四方面提供了呼吸道樣品處理方法，針對不同取樣方法、樣品物理性質，采用稀釋液化、離心收集等方法，最大效率富集樣品中的細胞。

該方法不僅適用于用于人呼吸道宏基因組學研究，也適用于人體其他部位例如口腔、消化道、皮膚、生殖道宏基因組學研究，可以有效降低人DNA的高背景干擾，從而有效富集微生物DNA，減少宿主DNA背景引起的測序數據浪費，提高有效數據的產出量，更深入的挖掘宏基因組中微生物信息。


圖1為支氣管及肺泡灌洗液與氣道分泌物總DNA凝膠電泳圖。圖2為質粒標準品繪制的qPCR標準曲線。圖3為實施例1中混合樣品原液、雜交液回收液以及磁珠清洗液中質粒qPCR絕對定量擴增曲線。3組曲線簇自左至右分別代表模擬混合DNA原樣，雜交液BW，清洗液W，橫線表示閾值線。
具體實施例方式實驗例支氣管肺泡灌洗液(BAL)、氣道分泌物以及全血總DNA提取 一、支氣管肺泡灌洗
對彌漫性間質性肺疾病選擇右肺中葉(B4或B5)或左肺舌段，局限性肺病變則在相應支氣管肺段進行灌洗。首先在要灌洗的肺段經活檢孔通過細硅膠管注入2%利多卡因f 2ml，做灌洗肺段局部麻醉；然后將纖支鏡頂端緊密楔入段或亞段支氣管開口處，再經活檢孔通過硅膠管快速注入37°C滅菌生理鹽水。每次25 50ml，總量10(T250ml，一般不超過300ml ;立即用5(Tl00mmHg負壓吸引回收灌洗液，通常回收率為40%飛0% ;將回收液體立即用雙層無菌紗布過濾除去粘液，并記錄總量；裝入硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細胞粘附)，置于含有冰塊的保溫瓶中。二、氣道分泌物吸引
選擇合適的吸痰管，吸痰管的外徑不應超過氣管導管內徑1/2 ;檢查吸痰裝置是否完好，吸引負壓應不超過-50mmHg ;清潔口腔之后進行純氧膨肺，氣道灌洗。阻斷吸痰管負壓，將吸痰管插入氣管導管作，吸痰后吸凈口咽部分泌物。，達到氣管導管末端時上提O. 5cm開放負壓，旋轉上提；吸痰動作輕柔、迅速，每次吸痰時間不超過15秒；嚴格無菌操作。三、儀器與試 劑準備
ABI 7500 實時突光定量 PCR 儀(Applied Biosystems, Life Technologies 公司)。Qubit 2· O 突光定量儀(Invitrogen, Life Technologies 公司)。蛋白酶K :將100 mg蛋白酶K溶于5 mL雙蒸水,配制成20 mg/ml的溶液，-20°C保存。IL PBS 緩沖液(ρΗ7· 4)
磷酸二氫鉀(KH2PO4)(購自北京化工廠)，0.27g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(購自西隴化工)，1. 42g 氯化鈉(NaCl)(購自西隴化工)，8g 氯化鉀(KCl)(購自北京化工廠)，0.2g
加去離子水約800 mL充分攪拌溶解,然后加入濃鹽酸調pH至7. 4,最后定容到1L,高
溫高壓滅菌后室溫保存。DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN，貨號 51306)。四、提取步驟
1、取灌洗液收集l 5ml，13000rpm離心濃縮10分鐘，棄上清，加入等體積PBS稀釋，輔助溶解分散，對于粘稠的氣道分泌物，需要先用2 3倍體積PBS進行稀釋，輕柔混勻進行勻質化；
2、準備若干1.5ml離心管，每管加入50μ I蛋白酶K于管中；3、每管加入500μ I稀釋分散后的呼吸道分泌物樣品，不足500 μ I用PBS補足；
4、每管加入500 μ I buffer AL (QIAamp DNA Mini Kit)，輕柔混勻 15 秒后置于 56°C水浴鍋中，孵育10分鐘；
5、取出后,快速離心,將管壁與管蓋上的液滴收集回管內，加入500μ I無水乙醇,渦旋混勻15秒，快速離心后，將管內全部混合物轉移至離心柱中(可分兩次進行)，SOOOrpm離心I分鐘，轉移離心柱至新離心管中；
6、加入500μ I buffer AW1，8000rpm離心I分鐘，棄掉管內液體;
7、加入500μ I buffer AW2，14000rpm離心3分鐘，棄掉管內液體后，空甩I分鐘；
8、轉移離心柱至1.5ml新離心管中，加入30 μ I雙蒸水，室溫放置2分鐘后，8000rpm離心一分鐘。提取出的總DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖1，M DL2000,條帶由大到小為2000bp, IOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0泳道I和泳道2為氣道分泌物提取獲得的DNA，濃度分別為72ng/ μ 1，15ng/ μ I ;泳道3和泳道4為支氣管肺泡灌洗液提取獲得的DNA，濃度均為2Ing/μ I。從圖1可看出基因組DNA條帶完整。 圖2為質粒標準品繪制的qPCR標準曲線。標準品采用BAP質粒(2. 6 kbp)5倍梯度稀釋成5個濃度梯度的樣品，由標準品濃度以及Ct值繪制標準曲線，用于定量分析樣品中質粒含量。圖中橫坐標Log CO表示模板濃度，縱坐標Ct表示樣品的Ct值，每個方形點表示標準樣品。由此進行模擬實驗中雜交前后樣品中質粒的定量。

灌洗液與全血參照上述步驟進行總DNA提取。實施例雜交消減降低宏基因組DNA中宿主DNA背景
本發明利用Alu序列在人DNA中出現頻率高的特點，針對Alu家族序列以及兩端保守區域設計探針，5’端用生物素標記，并將不同序列的多種探針配合使用，通過聯袂親和素包被的磁珠，將雜交復合DNA捕獲出來，從而減少宿主DNA在宏基因組中的背景干擾。所需試劑及母液配制
20X SSPE :稱取210. 6g NaCl (購自西隴化工)，27. 6g NaH2PO4H2O (購自北京化工廠)，
5.845g EDTA(購自西隴化工)，去離子水溶解，調整pH至7. 7，定容至1L，過濾除菌分裝，4°C保存。100XDenhardtJ s regent 溶液稱取 2g 聚鹿糖(Ficoll,400 型，購自 Sigma), 2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，購自Sigma，P_3004)，2g BSA (購自索寶來生物科技)，加水至總體積為100ml。過濾除菌，分裝成小份，_20°C貯存。20 X SSC :稱取88. 2g檸檬酸鈉(購自西隴化工)，175. 3g NaCl，加900ml水溶解，用NaOH (購自北京化工廠)調節pH至7.0，去離子水定容至1L，過濾除菌。 10%SDS溶液取IOgSDS (購自北京全新拓達科技),去離子水溶解,定容至100ml。IM Tris-HCl ;稱取72. 66gTris_base (購自北京全新拓達科技),加入500ml去離子水，用HCl (購自北京化工廠)調節pH至7. 5，定容至600ml。50mM EDTA溶液稱取1. 86gEDTA溶于IOOml去離子水。4M NaCl溶液稱取23. 376gNa0H溶于IOOml去離子水。以上母液均用過濾法除菌。雜交液50ml2 X B&ff buffer 取 O. 5ml IM Tris-HCl (pH 7. 5)，Iml 50mMEDTA, 25ml 4M NaCl，加水至 50ml。50ml 2X 雜交液 HYB buffer :取 25ml 20X SSPE 溶液，5ml 100XDenhardtJ s 溶液，IOml 50mM EDTA, Iml 10% SDS，加水至 50ml。50ml 磁珠清洗液 wash buffer :取 2. 5ml 20 X SSC, 0. 5ml 10%SDS,加水至 50ml探針變性磁珠回收液(0. 15M NaOH):稱取O. 6gNa0H，溶于IOOml去離子水中，分裝保存。實施例1對模擬混合樣品進行探針雜交消減(先雜交后偶聯)
1、模擬混合DNA取20μ l (按人全血DNA與2815bp質粒按照納克量9 1混合，總量約100ng/μ l)于200 μ I管中，置于PCR儀中95°C預熱5分鐘，65°C 5分鐘；取27 μ l 2X雜交液HYB置于PCR儀中65°C預熱5分鐘；
2、取序列號為SEQID NO Γ70的探針各O.1 μ 1，約70pmol，65°C預熱2分鐘；
3、混合上述體系共54μ1，65°C，雜交1小時；
4、取磁珠M-280 (invitrogen) 30 μ l,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，棄上清，用 54 μ l2XB&W重懸；
5、將雜交體系(54μ l)加入磁珠中，混勻，室溫下(20°C 25°C)孵育15分鐘，期間輕彈
管壁，混勻；
6、磁珠結合過程結束之后，將1.5ml離心管置于磁力架上，室溫放置廣2分鐘，待磁珠吸附到管壁之后，吸取上清保留，標記為BW ；
7、用100μ lwash buffer，輕輕吹打清洗磁珠，然后置于磁力架上靜止，上清吸出保留標記為W，再重復2次；
8、用ΙΟΟμΙwash buffer,輕輕吹打清洗磁珠,然后置于磁力架上靜止,上清吸出保留標記為W，再重復2次；將回收回來的雜交液BW與wash buffer清洗之后的回收液W用Qiagen PCR 純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit，QIAGEN，貨號 28106)柱回收DNA，5μl洗脫0嫩。磁珠可按如下的方法保存20μ I O. 15Μ NaOH溶液重懸磁珠，室溫下孵育10分鐘，置于磁力架上廣2分鐘后去除上清，加30μ I 1 X B&ff buffer溶液，4 °C保存磁珠。磁珠用50 μ l1 X SSC溶液清洗之后，加入50 μ L 1 X SSC重懸磁珠，95°C孵育5分鐘，置于磁力架上靜置廣2分鐘后，移除上清，加入30 μ L 1XB&W溶液保存。實施例2對呼吸道灌洗液樣品總DNA進行探針雜交消減(先雜交后偶聯)
除了在實施例1步驟I中，選用人呼吸道灌洗液樣品DNA、取2Χ雜交液HYB 32μ1、步
驟2中取序列號為SEQ ID NO Γ4的探針各3 μ I(約120pmol )、步驟4中用64 μ I 2 XB&ff重懸以外，以與實施例1中相同的方法和條件進行先雜交后偶聯探針雜交消減。實施例3對模擬混合樣品進行探針雜交消減(先偶聯后雜交)
1、取磁珠M_280(invitrogen)30 μ I,用 2XB&W buffer 清洗 2 次，棄上清，加入 15 μ I2 X B&ff buffer重懸磁珠；
2、向重懸的磁珠中加入序列號為SEQID NO 7Γ139的探針各O.1 μ I (約70pmol)以及8 μ I ddH20，室溫下孵育15分鐘，期間輕旋混勻；置于磁力架室溫放置f 2分鐘，去上清；
3、模擬混合DNA取20μ I (按人全血DNA與約2. 6kbp質粒按照納克量9 I混合，總量約IOOng/μ I)于200 μ IPCR管中，置于PCR儀95°C預熱5分鐘，65°C 5分鐘；取26μ I
2X雜交液HYB置于PCR儀中65°C預熱5分鐘；4、將混合DNA和雜交液加入磁珠中，混勻，置于PCR儀中65°C，雜交I小時，期間間隔混
勻；
5、雜交結束之后步驟參照實施例1的步驟6-8。實施例4對呼吸道灌洗液樣品總DNA進行探針雜交消減(先偶聯后雜交)
除了步驟2中加入12種序列號為SEQ ID NO :1 12的探針各1μ l(120pmol)以及3μ I水、步驟3中取人呼吸道灌洗液樣品DNA樣品20 μ I外，以與實施例3中相同的方法和條件進行先偶聯后雜交探針雜交消減。檢測例I測定雜交消減前后宿主DNA的降低
利用實時熒光定量PCR進行絕對定量分析，測定雜交消減前后混合樣品中質粒DNA的含量差異，以及人DNA與質粒DNA的比例差異。實時熒光定量PCR試劑采用THUNDERBIRDProbe qPCR Mix(Toyobo)，選取質粒上特定序列設計的序列號為SEQ ID NO :142和SEQ IDNO :143的引物和序列號為SEQ ID NO :144的探針，探針的5’端標記FAM熒光集團，3’端標記TAMRA淬滅集團。依照THUNDERBIRD Probe qPCR Mix說明書進行Realtime-PCR實驗。通過標準樣對雜交前后質粒DNA的含量進行絕對定量，每個樣品3個重復樣。Q-bit熒光定量測定DNA樣品的總DNA含量之后，用總量減去質粒DNA量，即為人DNA含量，測定以ng為單位，結果見表I。圖3為實施例1中混合樣品 原液、雜交液回收液以及磁珠清洗液中質粒qPCR絕對定量擴增曲線。3組曲線簇自左至右分別代表模擬混合DNA原樣，雜交液BW，清洗液W。綠色橫線表示閾值線，閾值線與擴增曲線相交處對應的循環數即為Ct值，通過Ct值可以比較計算初始DNA模板量。Ct值越小，初始模板濃度越大，結合DNA溶液體積即可計算初始模板總量。經過實時熒光定量PCR對混合DNA原液和雜交回收液中的質粒進行絕對定量分析，合并BW和W純化回收之后得到的質粒量。實施例1中，質粒回收效率約為初始混合DNA中質粒的91%，雜交之后人與質粒DNA量(ng)比例約為1:1 ;實施例3中，質粒回收效率約為初始混合DNA中質粒的83. 5%，雜交之后人與質粒DNA量(ng)比例約為O. 92 1，能夠有效減少人DNA的含量，結果見表I。表I定量分析實施例1和3中雜交前后的質粒DNA和人DNA含量及比例。
權利要求
1.一種宏基因組提取方法，其特征在于利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA的影響。
2.根據權利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針與所述宿主基因組DNA樣品雜交后與所述磁珠偶聯。
3.根據權利要求2所述的宏基因組提取方法，其特征在于包括步驟 1)將標記有生物素的所述探針與提取的所述宿主宏基因組DNA樣品進行雜交； 2)用包被有鏈霉親和素的所述磁珠捕獲探針與所述宿主DNA的復合體，并用磁力架分離磁珠-探針-目標DNA復合物； 3)將去除所述磁珠-探針-目標DNA復合物的雜交液以及雜交后的磁珠清洗液進行純化回收DNA。
4.根據權利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針與所述磁珠偶聯后與所述宿主基因組的雜交。
5.根據權利要求4所述的宏基因組提取方法，其特征在于包括步驟 1)利用包被有鏈霉親和素的所述磁珠與標記生物素的所述探針偶聯； 2)將偶聯好的復合物與所述宿主宏基因組DNA樣品雜交； 3)去除磁珠-探針-目標DNA復合物，對雜交液和雜交清洗液進行純化回收DNA。
6.根據權利要求1飛的任一項所述的宏基因組提取方法，其特征在于在偶聯溫度下使用多種正反向探針。
7.根據權利要求3或5所述的宏基因組提取方法，其特征在于雜交完成之后，對所述磁珠-探針-DNA復合物進行加熱或者氫氧化鈉法變性，回收偶聯有探針的磁珠。
8.根據權利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述探針選自序列表中的序列 SEQ ID NO 1 至序列 SEQ ID NO :139。
9.根據權利要求1所述的宏基因組提取方法，其特征在于所述宿主宏基因組DNA樣品取自人呼吸道、口腔、消化道、皮膚或生殖道。
全文摘要
本發明公開了宏基因組提取方法，所述方法利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中宿主DNA。所述方法利用宿主DNA中的重復序列Alu序列及其兩端保守序列作為模板，設計單向或者雙向探針，其中每條探針的5’端以生物素修飾，使用包被有鏈霉親和素的磁珠捕獲與探針雜交的宿主DNA，以達到減弱宏基因組中宿主DNA背景、提高測序數據有效率的目的。
文檔編號C12N15/10GK103060309SQ20121058061
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年9月25日
發明者任魯風, 王緒敏, 楚亞男, 高靜, 谷嵐, 隋碩, 康禹, 徐力, 袁麗娜, 張奕杰, 高占成, 于軍 申請人:中國科學院北京基因組研究所, 北京大學人民醫院