專利名稱：一種豬肺炎支原體的培養方法
技術領域：
本發明涉及支原體培養的技術領域，具體涉及一種豬肺炎支原體的培養方法。
背景技術：
豬肺炎支原體可以引起豬氣喘病，該病是一種接觸性慢性呼吸道傳染病。豬感染后會降低飼料轉化率，影響生長發育，并引起其他病毒及細菌的繼發感染。由豬肺炎支原體所引起的豬氣喘病普遍存在于養殖業發達的國家，該病一直以來是困擾我國養殖業發展的重要疾病。據統計，2010年我國生豬出欄近6億頭，90%以上養殖基地和規模化養豬場都存在著感染豬肺炎支原體的風險，國內該病的感染率可高達80%，是造成我國養豬業經濟損失的重要傳染病之一。目前疫苗免疫是預防本病的最主要手段。據資料報道，在發達國家，豬支原體肺炎的免疫率達70%，而我國由于進口疫苗價格昂貴，豬群免疫率不足10%，年經濟損失達300多億元人民幣，嚴重影響了養豬業的經濟效益。目前，我國在動物疫苗技術研發與世界先進水平相比還存在較大差距，豬肺炎支原體的培養難度很大，傳統的培養方式耗時長，并且滴度不高，是目前支原體疫苗規模化生產的技術瓶頸。針對豬支原體肺炎疫苗生產現狀，我們開展了改進豬支原體肺炎疫苗制備方法的研究，從生產工藝方面做了大量的探索、研究試驗，最終獲得了重大突破。

發明內容
本發明的目的在于提供一種豬肺炎支原體的培養方法。目前，培養豬肺炎支原體是按照以下步驟進行的1.培養基配方種子液和制苗用菌液均用此培養基。PPLO 培養基滅活豬血清(200 m L / L )酵母浸出液(10 mL / L)青霉素20萬單位葡萄糖(4g/L)用Na O H調 ρ H至 8. O。2.豬肺炎支原體菌株鑒定標準豬肺炎支原體種子培養物及生產培養物均用顯微鏡檢查其形態，鏡下體積小，呈現多形性，在制備一個新生產種子時，需要檢驗培養物特有的生化及免疫化學特性，典型的反應為葡萄糖反應陽性、甘露糖反應陽性、精氨酸反應陰性、尿素酶反應陰性、豬肺炎支原體抗血清一致生長實驗陽性。用免疫熒光標記的豬肺炎支原體抗體作直接熒光抗體實驗為陽性。3.種子液的制備3.1 一級種子繁殖及鑒定啟封冷凍菌種，用培養基將其融化復原，然后以10%(v/v)的量接種于培養基中，37°C培養15-96h，純檢合格后作為一級種子備用。3. 2 二級種子繁殖及鑒定取一級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，37±2°C培養15_96h，純檢合格后作為二級種子備用。3. 3種子罐制備取二級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，溫度控制37±2°C，通氣培養15-96h，純檢合格后備用。4、菌液制備以合格的種子液按5%_20% (v/v)的量接種到培養基，PH值8. 0±0· 5，溫度控制 37±2°C，純檢和活菌計數，一直到所需的量。按此方法生產，一般需要培養70-96個小時后才能達到109(XU/ml，并需要經過不定時的對培養液進行測定PH值，這樣操作在大規模生產豬支原體肺炎疫苗時會帶來較高風險的污染，并耗時較長，并對操作人員要求較高，生產難度大，產量低、成本高。為了解決目前現有技術中存在的問題，本發明提出了一種新的用于豬肺炎支原體的培養方法，具體包括以下步驟(I)種子液的制備①一級種子繁殖及鑒定啟封冷凍菌種，用培養基將其融化復原，然后以10%(v/v)的量接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，37°C培養15-96h，純度檢驗合格后作為一級種子備用；②二級種子繁殖及鑒定取一級種子按接種量10%(v/v)接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，37±2°C培養15-96h,純度檢驗合格后作為二級種子備用；③種子罐制備取二級種子按接種量10% (v/v)接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，溫度控制37±2°C，通氣培養15-96h，純度檢驗合格后備用；(2)菌液制備以合格的種子液按5%_20% (V/V)的量接種到含有4ml/L酚紅的PPLO培養基，pH值8. 0±0. 5，溫度控制37±2°C，通氣培養，并每12h加入Imo 1/L NaOH將PPLO培養基pH調至8. O,純度檢驗和活菌計數，至所需支原體濃度的量。在本發明中，優選的所述的含有4ml/L酚紅的PPLO培養基的組分為滅活豬血清200ml/L酵母浸出液10ml/L青霉素20萬單位葡萄糖4g/L酚紅4ml/Llmol/L NaOH 用于調節 pH 至 8· O。采用本發明的方法縮短了豬肺炎支原體的培養時間，降低了中間多次取樣檢測的程序，減少了培養過程中污染的可能性，并降低了由于人工操作帶來的誤差，相較于現有技術具有進步性。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1 :采用本發明的方法制備豬肺炎支原體1、菌種豬肺炎支原體P-5722-3株由哈藥集團生物疫苗有限公司保存。2、豬肺炎支原體的制備2.1.新培養基配方種子液和制苗用菌液均用此培養基。PPLO 培養基滅活豬血清(200m L / L ),酵母浸出液(10 mL / L)青霉素20萬單位葡萄糖(4g / L)，4 m L / L 酹紅(4 m L / L )用N a O H調 ρ H 至 8. O2. 2.豬肺炎支原體P-5722-3菌株鑒定標準豬肺炎支原體種子培養物及生產培養物均用顯微鏡檢查其形態，鏡下體積小，呈現多形性，在制備一個新生產種子時，需要檢驗培養物特有的生化及免疫化學特性，典型的反應為葡萄糖反應陽性、甘露糖反應陽性、精氨酸反應陰性、尿素酶反應陰性、豬肺炎支原體抗血清一致生長實驗陽性。用免疫熒光標記的豬肺炎支原體抗體作直接熒光抗體實驗為陽性。2. 3.種子液的制備2. 3.1 一級種子繁殖及鑒定啟封冷凍菌種，用培養基將其融化復原，然后以10%(v/v)的量接種于培養基中，37°C培養15-96h，純檢合格后作為一級種子備用。2. 3. 2 二級種子繁殖及鑒定取一級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，37±2°C培養15_96h，純檢合格后作為二級種子備用。2. 3. 3種子罐制備取二級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，溫度控制37±2°C，通氣培養15-96h，純檢合格后備用。2. 4、菌液制備以合格的種子液按5%_20%的量接種到培養基，PH值8. 0±0. 5，溫度控制37±2°C，通氣培養，并每12小時加入lmol/L NaOH將培養基PH調整至8. O,純檢和活菌計數，一直到所含抗原濃度至少為108ccu/ml。試驗例I采用傳統方法制備豬肺炎支原體1、菌種豬肺炎支原體P-5722-3株由哈藥集團生物疫苗有限公司保存。
2、豬肺炎支原體的制備2.1.培養基配方種子液和制苗用菌液均用此培養基。PPLO 培養基滅活豬血清(200 m L / L )酵母浸出液(10 mL / L)青霉素20萬單位葡萄糖(4g / L) 用Na O H調 ρ H至 8. O。2. 2.豬肺炎支原體菌株鑒定標準豬肺炎支原體種子培養物及生產培養物均用顯微鏡檢查其形態，鏡下體積小，呈現多形性，在制備一個新生產種子時，需要檢驗培養物特有的生化及免疫化學特性，典型的反應為葡萄糖反應陽性、甘露糖反應陽性、精氨酸反應陰性、尿素酶反應陰性、豬肺炎支原體抗血清一致生長實驗陽性。用免疫熒光標記的豬肺炎支原體抗體作直接熒光抗體實驗為陽性。2. 3.種子液的制備2. 3.1 一級種子繁殖及鑒定啟封冷凍菌種，用培養基將其融化復原，然后以10%(v/v)的量接種于培養基中，37°C培養15-96h，純檢合格后作為一級種子備用。 2. 3.2 二級種子繁殖及鑒定取一級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，37±2°C培養15_96h，純檢合格后作為二級種子備用。2. 3. 3種子罐制備取二級種子按接種量10% (v/v)接種于培養基中，溫度控制37±2°C，通氣培養15-90h，純檢合格后備用。2. 4、菌液制備以合格的種子液按5%_20% (v/v)的量接種到培養基，PH值8. 0±0. 5，溫度控制37±2°C，通氣培養15-96h，純檢和活菌計數，一直到所含抗原濃度至少為108CCu/ml。試驗例2采用兩種方法制備的豬肺炎支原體抗原含量的比較采用本發明方法(實施例1)和傳統方法(試驗例I)在進行了六次平行實驗后，結果發現采用本發明方法，使得培養物在培養50-60小時后均能達到109CCU/ml以上，根據以上結果在隨后繼續做了四組平行試驗并從48小時開始計數，發現結果與預期相符。采用傳統培養方法與本發明培養方法所得到的豬肺炎支原體抗原含量的對比結果如表I所示。表I傳統培養方法與本發明培養方法對比單位(XU/ml
權利要求
1.一種豬肺炎支原體的培養方法，其特征在于培養步驟如下 (1)種子液的制備 ①一級種子繁殖及鑒定 啟封冷凍菌種，用培養基將其融化復原，然后以10% (v/v)的量接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，37°C培養15-96h，純度檢驗合格后作為一級種子備用； ②二級種子繁殖及鑒定 取一級種子按接種量10% (v/v)接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，37±2°C培養15-96h,純度檢驗合格后作為二級種子備用； ③種子te制備 取二級種子按接種量10% (v/v)接種于含有4ml/L酚紅的PPLO培養基中，溫度控制37±2°C，通氣培養15-96h，純度檢驗合格后備用； (2)菌液制備 以合格的種子液按5%-20% (V/V)的量接種到含有4ml/L酚紅的PPLO培養基，pH值8.0±0. 5，溫度控制37±2°C，通氣培養，并每12h加入lmol/L NaOH將PPLO培養基pH調至8.O,純度檢驗和活菌計數，至所需支原體濃度的量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有4ml/L酚紅的PPLO培養基的組分為 滅活豬血清200ml/L 酵母浸出液10ml/L 青霉素20萬單位 葡萄糖4g/L 酹紅4ml/L lmol/L NaOH 用于調節 pH 至 8. O。
全文摘要
本發明涉及一種豬肺炎支原體的培養方法，包括種子液的制備和菌液的制備，與傳統方法的不同在于菌液制備過程中，本發明每12h加入1mol/LNaOH將含有4ml/L酚紅的PPLO培養基pH調至8.0。采用本發明的方法縮短了豬肺炎支原體的培養時間，降低了中間多次取樣檢測的程序，減少了培養過程中污染的可能性，并降低了由于人工操作帶來的誤差。
文檔編號C12R1/35GK103013892SQ20121058325
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者陳欣, 張鳳強, 劉洪斌, 付麗杰, 左穎, 趙凱, 王旭然 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司