專利名稱：一種磷酸肌酸鈉的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種利用基因工程技術制備磷酸肌酸鈉的方法。
背景技術：
磷酸肌酸是肌肉或其他興奮性組織(如腦和神經)中由肌酸與磷酸組成的一種高能磷酸化合物，其高能特性使其成為運動補劑，廣泛被運動員使用。另外，磷酸肌酸鈉作為心肌細胞保護劑和能量供給物，用于心肌缺血、心衰等輔助性治療，或應用于臨床外科手術之中，其臨床療效確切，安全性高。磷酸肌酸鈉最先由歐輝制藥廠開發并于1992年在意大 利上市，1995年進口至我國。目前，國內生產磷酸肌酸鈉的工藝路線有化學法和生物法(酶法)。化學合成方法分為鋇鹽工藝和無鋇鹽工藝。鋇鹽工藝采用三氯氧磷、硫酸鋇和肌酸合成(哈爾濱理工大學學報，2004年，9卷04期，124頁-126頁)。無鋇鹽工藝如US3036087以亞磷酸二芐酯及甲基異硫脲為原料，經多步化學反應生成磷酸肌酸鈉。無論是鋇鹽工藝或是無鋇鹽工藝，化學合成法反應步驟復雜條件苛刻，而且大量使用酸堿、有毒有害化工原料(如鋇鹽、氯化汞等)和有機溶劑，不僅增加了注射藥物使用的安全隱患，而且不可避免的對環境造成巨大破壞。生物法分為生物組織提取法和基因工程法，前者是從動物肌肉中提取肌酸激酶，以肌酸和三磷酸腺苷為底物反應生成磷酸肌酸鈉。基因工程法是用基因工程方法重組構建含有肌酸激酶的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規模高密度培養并分離純化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到磷酸肌酸鈉。現行生物組織提取法以動物肌肉組織為原料提取肌酸激酶，由于肌肉中該酶含量較低，且缺乏特異性純化方法，使得產品成本過高且產品中雜蛋白去除困難。此外，酶催化反應過程中ATP的大量消耗和一次性投入的方式，亦增加了產品的成本。現行基因工程法是用基因工程方法重組構建含有肌酸激酶的大腸桿菌工程菌株，由于合成磷酸肌酸鈉時，需要額外再添加ATP且采用一次性投入，產品成本較高。

發明內容
本發明的目的是提供一種磷酸肌酸鈉的制備方法。所述方法是利用基因工程技術分別構建肌酸激酶和乙酸激酶表達菌株，解除肌酸激酶的動物來源限制，利用親和純化技術特異性純化肌酸激酶和乙酸激酶，將肌酸激酶和乙酸激酶共固定至載體顆粒上，形成共固定化酶，在肌酸激酶催化生成磷酸肌酸鈉的同時，乙酸激酶不斷再生ATP用以持續反應，最終提供成本低廉、綠色無污染的磷酸肌酸鈉。本發明制備的磷酸肌酸鈉鹽化合物如(I)所示
權利要求
1.一種制備磷酸肌酸鈉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(O分別構建肌酸激酶和乙酸激酶表達菌株，誘導表達并進行破碎處理；(2)采用特異性金屬螯合親和純化方法制備高純度的肌酸激酶和乙酸激酶；(3)將肌酸激酶和乙酸激酶共固定至載體顆粒上，形成共固定化酶；(4)共固定化酶催化反應生成磷酸肌酸鈉；(5)離子交換樹脂分離純化磷酸肌酸鈉。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)為分別合成肌酸激酶基因和乙酸激酶基因，將肌酸激酶基因和乙酸激酶基因分別連至克隆載體上，轉化大腸桿菌，篩選得到正確的克隆載體，并分別構建含肌酸激酶基因和乙酸激酶基因的表達載體，然后分別將這兩種重組載體通過化學轉化或電轉化的方式轉入表達型大腸桿菌，構建表達型大腸桿菌重組菌，誘導表達并進行破碎處理；其中，所述肌酸激酶基因是兔肌肉型、兔腦型、牛線粒體型、人雜化型或人線粒體型的肌酸激酶基因；所述乙酸激酶基因是反芻月形單胞菌K6、埃氏巨型球菌、保加利亞乳桿菌或者 Marinithermus hydrothermal is DSM14884 的乙酸激酶基因；所述克隆載體為pBluescript系列或pUC19 ;所述表達載體為pET22、pET28、pET15或 pET43 ；所述大腸桿菌為DH5 a、ToplO或JM109 ;所述表達型大腸桿菌為BL21 (DE3)。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述肌酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述乙酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)為利用特異性金屬螯合親和層析柱純化破碎的大腸桿菌重組菌菌液，菌液以25-45BV/h的流速過柱，以30-50BV/h流速洗脫，洗脫液經除鹽處理后得到純化的肌酸激酶和乙酸激酶。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)為將純化后的肌酸激酶、乙酸激酶與固定化載體顆粒按1000-5000U: 1200-6800U:50-250g比例進行混合，進行固定化反應，固定化過程中加入硫酸銨固體粉末至終濃度250-350mM，固定化溫度為15-35°C，時間為10-50h,固定化過程中控制pH值為5. 5-6. 5。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化載體顆粒為環氧型樹脂。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)為配制共固定化酶催化反應的反應物溶液，所述反應物溶液中ATP濃度為10-50mM，肌酸濃度為ATP濃度的1_5倍，鎂離子濃度為ATP濃度的1-5倍，乙酰磷酸濃度為ATP濃度的1-5倍，加入緩沖體系使反應物溶液的PH值為8-10，再加入100-500g的共固定化酶顆粒，催化反應的溫度為25-45°C，反應過程中不斷滴入稀堿以維持PH在8. 0-9. O,當反應溶液的pH值不再變化時停止反應，篩網過濾分離共固定化酶顆粒和反應后的溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述緩沖體系為Gly-NaOH緩沖體系或 Na2B4O7-NaOH 緩沖體系。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)為將離子交換樹脂填裝層析柱， 步驟(4)反應后的溶液以6-10BV/h的流速過柱，以6-10BV/h的流速洗脫。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述樹脂為AmberliteIRA900, D201,D301樹脂中的一種。·
全文摘要
本發明涉及一種利用基因工程技術制備磷酸肌酸鈉的方法。所述方法是利用基因工程技術分別構建肌酸激酶和乙酸激酶表達菌株，解除肌酸激酶的動物來源限制，利用親和純化技術特異性純化肌酸激酶和乙酸激酶，將肌酸激酶和乙酸激酶共固定至載體顆粒上，形成共固定化酶，在肌酸激酶催化生成磷酸肌酸鈉的同時，乙酸激酶不斷再生ATP用以持續反應，最終提供成本低廉、綠色無污染的磷酸肌酸鈉。
文檔編號C12P13/00GK103014083SQ20121059097
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者許崗, 黃斌, 吳峰, 曾紅宇 申請人:湖南寶利士生物技術有限公司