專利名稱：基于納米顆粒和滾環擴增的核酸定性檢測方法
技術領域：
本發明屬于核酸分子檢測領域，具體涉及利用在二氧化硅納米顆粒表面進行滾環擴增前后顆粒的聚集形態變化，快速、簡易地實現核酸分子定性檢測的方法。
背景技術：
滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)是新近發展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環狀模板互補)，在特殊的DNA聚合酶(phi 29DNA聚合酶)催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA。其線性擴增倍數為105，指數化擴增能力大于109，實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分 子，在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。比如Juan Hu等人(Juan Hu, Chun-yangZhang ；Sensitive detection of nucleic acids with rolling circleamplification andsurface-enhanced raman scattering spectroscopy ;Anal.Chem. 2010，82，8991-8997)利用RCA實現了高靈敏度的核酸檢測，但是其中利用到了熒光探針來檢測，成本高，對儀器設備的要求較高。納米顆粒是一種人工合成的微小顆粒，它的形態可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C. A. , et al ；)發現表面修飾有核酸探針的13nm金顆粒溶液中加入與修飾核酸互補配對的目標核酸分子時，由于金顆粒的聚集溶液的顏色會由紅變藍。自此利用納米顆粒來進行生物分子檢測的研究廣泛開展開來。目前通用的方法主要分為兩種，一種是利用在金或銀納米顆粒修飾核酸探針，根據溶液的顏色變化來檢測目標核酸分子，優點檢測方法簡單，但是所用的納米顆粒成本較高；另一種是利用在顆粒表面修飾核酸分子，通過不同的核酸擴增手段后加入熒光探針來進行目標分子檢測，優點是檢測的靈敏度相對更好，但是熒光探針的成本也較高。且這些檢測方法都著眼于定量的檢測，而臨床上很多疾病的檢測只需要判斷有或無即可，不需要進行定量的檢測。

發明內容
本發明的目的在于針對上述問題，提供一種在二氧化硅納米顆粒表面進行滾環擴增以實現核酸分子快速、高靈敏度的定性檢測方法。本發明所述的基于滾環擴增檢測目標核酸的方法，其特征在于利用滾環擴增之前二氧化硅納米顆粒在溶液中呈自由分散狀態，加入目標核酸分子滾環擴增之后溶液中的二氧化硅納米顆粒聚集成肉眼可分辨的白色團塊狀物的現象，實現對核酸分子的快速、高靈敏度的定性檢測。為實現上述目的，本發明的檢測方法包括以下步驟I)將待測目標核酸分子的捕獲探針修飾到二氧化硅納米顆粒表面；2)加入引物探針、BSA、DNA連接酶及目標核酸分子與捕獲探針雜交；3)加入環狀DNA、BSA、聚合酶及擴增原料進行滾環擴增；
4)當ニ氧化硅納米顆粒的聚集狀態由自由分散狀態變為白色團塊狀物時，則判定目標核酸分子存在。步驟I)中，所述目標核酸分子為單鏈DNA或RNA。步驟I)中，所述ニ氧化硅納米顆粒，大小為540nm ;其表面帶有鏈激酶親和素修飾。步驟I)中，所述捕獲探針為一段單鏈DNA片段，其5’端帶有連接分子修飾，其中所述連接分子為生物素，通過與鏈激酶親和素結合，將捕獲探針修飾到顆粒的表面；所述捕獲探針與目標核酸分子的5’末端一段序列互補配對。步驟2)中，所述引物探針為一段單鏈DNA，其5’端帶有磷酸基團修飾。 進ー步地，所述的引物探針的5’末端序列與目標核酸分子的3’末端的一段堿基互補配對。進ー步地，所述的引物探針的3’末端序列與環狀DNA的一段堿基互補配對，作為滾環擴增的引物。步驟2)中，所述的DNA連接酶包括T4DNA連接酶。步驟3)中，所述的環狀DNA為單鏈環狀DNA，為滾環擴增的模板。步驟3)中，所述的DNA聚合酶為等溫聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。步驟3)中，所述的核酸擴增原料，當檢測目標核酸分子為單鏈DNA時為四種脫氧核糖核苷酸，當檢測目標核酸分子為RNA時為四種核糖核苷酸。本發明利用滾環擴增前后顆粒聚集狀態的改變來判斷目標核酸分子的有無，提供了ー種簡易、快速、高靈敏的核酸分子定性檢測方法，其有益效果如下a)滾環擴增前后顆粒聚集狀態的改變通過肉眼即可明顯觀察到，無需專門的檢測儀器，降低檢測的成本，適合臨床檢測的推廣；b)利用了滾環擴增的高效性，能實現快速、高靈敏度的定性檢測；c)檢測的步驟較少，所涉及的實驗方法簡單；d)檢測體系所用的物質均是商品化的產品，可以很容易在市場上買到或合成，適于大規模生產。


圖1為利用滾環擴增前后顆粒聚集狀態不同實現定性檢測的原理圖(其中，I ニ氧化硅顆粒；2.鏈激酶親和素；3.親和素；4.捕獲探針；5.引物探針；6.目標核酸分子；7.捕獲探針和引物探針連接產物；8.環狀DNA;9.滾環擴增后的長鏈DNA; 10.滾環擴增后形成的顆粒團聚物)。圖2為目標DNA濃度分別為lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滾環擴增前顆粒聚集狀態的實物圖。圖3為目標DNA濃度分別為lfM，IOfM, IOOfM, IOOOfM滾環擴增后顆粒聚集狀態的實物圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例進ー步闡述在納米顆粒表面進行滾環擴增對核酸分子進行定性檢測的方法。1.檢測探針的設計與合成
權利要求
1.一種基于滾環擴增的核酸定性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將待測目標核酸分子的捕獲探針修飾到二氧化硅納米顆粒表面； 2)加入引物探針、BSA、DNA連接酶及目標核酸分子與捕獲探針雜交； 3)加入環狀DNA、BSA、聚合酶及擴增原料進行滾環擴增； 4)當二氧化硅納米顆粒的聚集狀態由自由分散狀態變為白色團塊狀物時，則判定目標核酸分子存在。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述目標核酸分子為單鏈DNA或RNA。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述二氧化硅納米顆粒，直徑為540nm,其表面帶有鏈激酶親和素分子修飾。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述捕獲探針為一段單鏈DNA片段，其5’端帶有連接分子修飾。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述捕獲探針的3’末端堿基與目標核酸分子的5’末端堿基互補。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述連接分子為生物素，通過與鏈激酶親和素結合，將捕獲探針修飾到顆粒的表面。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的引物探針為一段單鏈DNA，其5’端帶有磷酸基團修飾。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的引物探針5’末端序列與目標核酸分子的3’末端的一段堿基互補配對，其3’末端序列與環狀DNA的一段堿基互補配對。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的DNA連接酶包括T4DNA連接酶。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的環狀DNA為單鏈環狀DNA，為滾環擴增的模板。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的聚合酶為等溫聚合酶，包括Phi 29DNA聚合酶，RNA聚合酶。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述的核酸擴增原料，當檢測目標核酸分子為單鏈DNA時為四種脫氧核糖核苷酸，當檢測目標核酸分子為RNA時為四種核糖核苷酸。
全文摘要
本發明提供一種基于納米顆粒和滾環擴增的核酸定性檢測方法。該檢測方法主要利用滾環擴增之前，二氧化硅納米顆粒在溶液中呈分散狀態，當存在目標核酸分子時，滾環擴增發生，二氧化硅納米顆粒聚集在一起，在溶液中形成肉眼可見的白色團塊狀物質，以達到定性檢測目標核酸分子的目的。該方法通過滾環擴增前后二氧化硅納米顆粒的聚集狀態即可判斷目標核酸分子的有無，既實現了對微量核酸分子的大量擴增，又實現了結果的快速直觀檢測，無需專門的檢測儀器，降低檢測的成本，適合臨床檢測的推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103014169SQ20121059133
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者桑建明, 王瑋 申請人:北京大學