專利名稱：基于DNA hairpin和RCA的核酸檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物分子檢測領域，具體涉及一種基于DNA hairpin和滾環擴增(RCA)實現核酸分子快速、高靈敏檢測的方法。
背景技術：
滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)是新近發展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環狀模板互補)，在特殊的DNA聚合酶(phi 29 DNA聚合酶)催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA。其線性擴增倍數為105，指數化擴增能力大于109，實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。比如Juan Hu等人(Juan Hu, Chun-yangZhang ；Sensitive detection of nucleicacids with rolling circle amplification and surface-enhanced raman scatteringspectroscopy ;Anal. Chem. 2010，82，8991-8997)利用RCA實現了高靈敏度的核酸檢測，但是其中設計過多分子探針設計，存在兩步酶促反應，增加了檢測的復雜性和檢測成本。DNA hairpin是指一段單鏈DNA分子末端局部互補配對形成的一種特定分子結構，分為莖部(hairpin)和環部(loop)兩個部分。DNA hairpin的莖-環結構在某些特殊的情況下可以打開，比如當另一段單鏈DNA與環部互補配對結合后，其莖-環結構就會打開。基于這種特性，多種核酸檢測方法被提出。比如Gwo-bin Lee等人(Y1-chih Su, et al ；Multiple pathogen detection for poultry byultilizing integrated microfluidicsystem ;MiciOTAS’ 2012)利用在DNA hairpin的5’端和3’端分別修飾上熒光分子和熒光猝滅分子的方法來檢測病原體DNA。但是熒光分子和熒光猝滅分子修飾價格昂貴，作為分子檢測的成本過高，不利于檢測方法推廣使用。

發明內容
本發明的目的在于利用DNA hairpin的環部與特定單鏈DNA或RNA互補配對結合后其莖部會打開，以及目標核酸分子的量不同，打開的莖-環結構就不同的特性，將DNAhairpin的莖部堿基序列設計為滾環擴增的引物，以簡化滾環擴增用于核酸檢測的步驟，以實現簡單，低成本，高靈敏度的核酸檢測。為實現上述目的，本發明采用以下步驟I)將DNA hairpin修飾到固體載體上；2)加入環狀DNA、酶、BSA、擴增原料；3)加入待測目標核酸分子，進行滾環擴增；4)擴增后對目標核酸分子進行定量檢測。步驟I)中，所述固體載體包括納米顆粒。步驟I)中,所述DNA hairpin,包括5’端連接分子修飾,環部,莖部。進一步地，所述5’端連接分子為生物素(biotin)，通過與固體載體表面鏈霉親和素(streptavidin)結合,將DNA hairpin修飾固定到載體表面；進一步地，所述環部堿基設計成能與目標核酸分子互補配對的堿基；進一步地，所述莖部的3’端堿基設計成能與滾環擴增的環狀DNA互補配對的堿基，作為滾環擴增的引物；步驟2)中，所述環狀DNA為單鏈環狀DNA，為滾環擴增的模板。步驟2)中，所述酶為恒溫酶，包括phi 29 DNA聚合酶，RNA聚合酶。步驟2)中，當檢測的目標分子是單鏈DNA時，擴增原料為四種脫氧核糖核苷酸，當檢測的目標分子是RNA時，擴增的原料為四種核糖核苷酸。步驟3)中，所述目標核酸分子包括單鏈DNA或RNA。本發明的核酸檢測方法利用了 DNA hairpin結構的可逆性和RCA的快速，簡易性，提供了一種簡易、高靈敏度的核酸分子檢測方法，其優點和積極效果如下a)利用DNA hairpin作為RCA的檢測探針,簡化了用RCA檢測分子的流程,減少了酶等生物試劑的使用，降低了檢測成本；b)利用了 DNA hairpin結構的可逆性，同時保留了 RCA用于核酸檢測高靈敏度等的優點；c)各種檢測原料包括DNA hairpin,環狀DNA,酶,擴增原料等均可在市場上買到，適于廣泛推廣使用。


圖1為滾環擴增過程示意圖；圖2為DNA hairpin通過與目標分子結合引起結構改變示意圖；圖3為結合DNA hairpin和滾環擴增用于核酸檢測的原理示意圖。附圖標記說明1.環狀DNA ；2.滾環擴增引物；3.滾環擴增的長鏈DNA ；4. DNA hairpin的環部；5. DNAhairpin的莖部；6.目標核酸片段；7.氫鍵；8.連接分子；9.固體載體。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述利用DNA hairpin和RCA進行核算定量檢測如方法。1. DNA hairpin的設計與合成
權利要求
1.一種基于DNA hairpin和RCA的核酸檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)將DNAhairpin修飾到固體載體上；2)加入環狀DNA、BSA、酶、擴增原料；3)加入待測目標核酸分子，進行滾環擴增；4)擴增后對目標核酸分子進行定量檢測。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述固體載體包括納米顆粒。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述DNAhairpin包括5’端連接分子、環部和莖部。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述環狀DNA為單鏈環狀DNA。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述酶為恒溫酶，包括phi29 DNA聚合酶或RNA聚合酶。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，當檢測的目標核酸分子是單鏈 DNA時，擴增原料為四種脫氧核糖核苷酸，當檢測的目標核酸分子是RNA時，擴增原料為四種核糖核苷酸。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述目標核酸分子包括單鏈DNA 或 RNA。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNAhairpin的5’端連接分子為生物素，通過與固體載體表面鏈霉親和素結合，將DNA hairpin修飾固定到載體表面。
9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNAhairpin的環部包括能與目標核酸分子堿基互補配對的堿基。
10.如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述DNAhairpin的莖部的3’端包括能與環狀DNA分子互補配對的堿基。
全文摘要
本發明提供了一種基于DNA hairpin和RCA的核酸檢測方法。該檢測方法通過將環部與目標DNA互補，莖部與環狀DNA部分互補的DNA hairpin修飾到固體載體上；再加入環狀DNA、酶、擴增原料等；當檢測體系中加入目標核酸分子時，目標核酸分子與DNA hairpin的環部互補配對，莖-環結構打開，莖部的堿基與環狀DNA雜交結合，RCA發生，目標核酸分子的量不同，打開的莖-環結構就不同，進而利用光學或電學的方法實現目標核酸分子定量。該方法以DNAhairpin作為RCA的檢測探針，簡化了用RCA檢測分子的流程，降低了檢測成本，同時保留了RCA用于核酸檢測高靈敏度等優點，適于推廣使用。
文檔編號C12Q1/68GK103014168SQ201210591068
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者桑建明, 王瑋 申請人:北京大學