專利名稱：一種重組甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制備甘露寡糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種 編碼重組的0 -甘露聚糖酶的畢赤酵母基因工程菌株的構建以及利用畢赤酵母表達甘露聚糖酶的方法，同時，利用該重組甘露聚糖酶水解高濃度甘露聚糖制備甘露寡糖的方法，在工業(yè)生產(chǎn)中無需調(diào)節(jié)PH，操作簡單，能夠降低生產(chǎn)成本，縮短工藝流程，簡化后續(xù)處理步驟。
背景技術：
甘露低聚糖是由2 — 10個單糖分子通過糖苷鍵連接而成的低度聚合糖，可以有效促進生物體內(nèi)以雙歧桿菌為代表的腸道有益菌群的特異性增殖，并具有抑制體內(nèi)病原菌生長、減少有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、防止便秘、保護肝臟、抗腫癌及增強機體免疫力等多種生理功能。此外，低聚甘露糖還具有不被人體降解、低甜度、不引發(fā)齲齒、不增加血糖濃度等特點，是新一代功能性食品。近年來，關于低聚糖的研究越來越多，已有多種功能性低聚糖產(chǎn)品投入市場，但目前大多數(shù)低聚糖產(chǎn)品屬于普通型的低聚糖，有效成分不足50%。歐美等國因限于資源，主要采用化學合成方法和從酵母細胞壁分離提取甘露低聚糖，其中酵母發(fā)酵法成本低，污染少，但它們的產(chǎn)品純度低、性能差。為了提高產(chǎn)品純度，必須在后續(xù)工藝中使用操作復雜成本過高的提純工序，例如離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法等。酵母發(fā)酵法生產(chǎn)的關鍵是甘露聚糖酶。如何尋找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，使產(chǎn)品的純度提高，使后續(xù)提純工序簡單有效，能低成本地生產(chǎn)高純度低聚糖，顯得尤為重要。甘露聚糖酶，是一類能夠水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的內(nèi)切酶，能水解植物膠(如角豆膠、瓜兒豆膠和魔芋等)生成低聚甘露糖。甘聚聚糖酶廣泛存在于自然界中，在動物、植物和微生物體內(nèi)有該酶的存在，而微生物是其主要來源。芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌、真菌中的曲霉、青霉、酵母菌和放線菌中的鏈霉菌都是產(chǎn)甘露聚糖酶的常見菌群。國內(nèi)現(xiàn)在有許多相關科研單位，如中科院微生物研究所，南開大學等廣泛進行了甘露聚糖酶及其相關內(nèi)容的研究，但所報道的發(fā)酵酶活性不高，酶解產(chǎn)物純度低，生產(chǎn)成本高，難以工業(yè)化。魔芋是我國南方地區(qū)的特有經(jīng)濟作物，其主要成分為葡甘聚糖，在西南貧困山區(qū)產(chǎn)量很高，目前在國內(nèi)主要作為一種粗纖維食糧或作為食品添加劑，附加值不高。將魔芋利用甘露聚糖酶經(jīng)酶法水解制成甘露低聚糖，有很好的市場前景。在生產(chǎn)中的一般甘露聚糖酶活性差，水解效率低，底物濃度低，不能適應生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是運用基因工程手段尋找畢赤酵母偏愛密碼，構建重組的￠-甘露聚糖酶基因，實現(xiàn)甘露聚糖酶的高效穩(wěn)定表達，同時利用表達的重組3 -甘露聚糖酶水解高濃度甘露聚糖制備甘露寡糖。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。本發(fā)明的步驟為:一、重組￠-甘露聚糖酶基因的合成在氨基酸序列不改變的前提下，對原始的P -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列利用DNAffORKS工具進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因全部由畢赤酵母偏愛密碼組成。優(yōu)化后的核苷酸序列與原始基因的核苷酸序列(GeneBank accession XM_001390670.1)相比，有257個核苷酸發(fā)生變化，核苷酸的同源性為76%。同時為了使￠-甘露聚糖酶在畢赤酵母中能夠高效穩(wěn)定的分泌表達，優(yōu)化后的￠-甘露聚糖酶基因少了編碼5’端信號肽序列的20個氨基酸。優(yōu)化前的序列:atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gtgctgcctc cacctccttc 120gccagcacct ccggcctcca attcaccatt gatggcgaaa ctggctactt cgccggaacg 180aacagctact ggatcggttt cctcactgac aacgcggacg tcgacctcgt catgggccac 240ctgaagtcgt ccggcctcaa gatcctccgc gtgtggggct tcaacgatgt cacctcgcag 300ccctcctccg gcacagtctg gtaccaactg caccaggacg gcaaatcgac aatcaacacg 360ggtgccgacg gtctccagcg cctcgactac gtcgtctcgt ctgccgaaca gcacgacatc 420aaactcatca tcaacttcgt caactactgg accgattacg gtggtatgtc tgcgtacgtg 480agcgcgtatg gc ggatccgg cgagacggat ttctatacca gtgataccat gcagagtgcc 540tatcagacat atatcaagac ggtcgtggag cggtacagta actcctcggc ggtgtttgcg 600tgggagttgg cgaatgagcc gagatgtccg agttgcgata cttctgtgtt gtataactgg 660attgagaaga cgagtaagtt tattaagggg ttggatgcgg atcgtatggt ttgtattggt 720gatgagggct tcggtctcaa catcgactcg gacggcagct acccttatca attctccgag 780ggcttgaact ttacgatgaa cctcggtatc gatactattg actttggtac cctccacttg 840taccctgata gctggggcac ctccgacgac tggggcaacg gctggatcac cgcccacggc 900gcagcctgca aagcggccgg caagccatgt ctcctggagg aatacggagt cacctcgaac 960cactgcagtg tggagggctc gtggcagaag acagcgctca gcacaacggg cgtcggcgcg 1020gatctgttct ggcagtatgg tgatgatttg agtaccggga agtcgccgga tgatgggaat 1080actatctact atgggactag tgattatcag tgcctggtga cggatcatgt tgctgctatt 1140ggtagtgctt aa 1152優(yōu)化后的序列為:atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600
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權利要求
1.一種重組甘露聚糖酶基因，其特征在于:優(yōu)化后的序列為:atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600atcgagaaga cctctaagtt catcaagggc ttggacgccg atagaatggt ttgtattggt 660gacgaaggtt ttggtttgaa tattgactcc gatggttctt acccatacca attctctgaa 720ggtctgaact ttaccatgaa cctaggcata gatactatcg actttggaac tctgcacttg 780tatccagatt catggggtac gtctgatgat tggggtaatg gctggatcac cgctcatgga 840gccgcctgca aggcagctgg taaaccttgt ttgttggagg aatacggtgt aacatctaat 900cactgttctg tggaaggttc ttggcagaag actgctttgt ctaccactgg tgtgggagct 960gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080ggttctgct 1089設計的引物序列為:man-lGTCAATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAGman-2TAGATGCAAAAGATGTAGAGGCGGCACTAGAAGAAGTGGATGGGGC 46man-3GCCTCTACATCTTTTGCATCTACTTCTGGCTTGCAGTTTACTATTG 46man-4CAGCAAAATAACCAGTTTCACCATCAATAGTAAACTGCAAGCCAGA 46man-5GGTGAAACTGGTTATTTTGCTGGTACTAACTCTTACTGGATTGGTT 46man-6ACATCAGCGTTATCAGTCAAAAAACCAATCCAGTAAGAGTTAGTAC 46man-7TTTTGACTGATAACGCTGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAA 46man-8TCTCAAAATCTTCAATCCTGAAGACTTCAAATGACCCATGACCAAA 46man-9TCTTCAGGATTGAAGATTTTGAGAGTTTGGGGTTTTAACGATGTCA 46man-1OACAGTACCACTAGATGGTTGAGAAGTGACATCGTTAAAACCCCAAA 46man-11TCAACCATCTAGTGGTACTGTTTGGTATCAACTACATCAGGATGGC 46man-12AGCACCTGTGTTAATAGTAGACTTGCCATCCTGATGTAGTTGATAC 46man-13AGTCTACTATTAACACAGGTGCTGACGGTTTGCAGAGATTGGATTA 46man-14GTGCTGTTCGGCTGAACTGACAACGTAATCCAATCTCTGCAAACCG 46man-15ACTTCAGCCCAACAGCACCATATCAAACTTATCATAAACTTCCTGA 46man-16CGCCCTAGTCTCTCCAATAATTCACGAAGTTTATCATAAGTTTGAT 46man-17TATTCGACAGACTACGGCGGCATGTCTGCATACGTTTCTGCTTACG 46man-18TAAAAATCAGTCTCACCAGATCCACCGTAAGCAGAAACGTATGCAG 46man-19GGATCTGGTGAGACTGATTTTTACACTTCTGACACTATGCAAAGTG 46man-20CTGTCTTAATGTACGTCTGCTAAGCACTTTGCATAGTGTCAGAAGT 46man-21CTTACCAGACCTACATTAAGACAGTTGTCGAGCGTTACTCTAATTC 46man-22AATTCCCAAGCAAAAACAGCAGAGGAATTAGAGTAACGCTCGACAA 46man-23TGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCTTCT 46man-24AGTTATATAGGACTGAAGTATCGCAAGAAGGACATCTTGGTTCGTT 46man-25CCCATACTTCACTCCTATATAACTGCATCGAGAAGACCTCTAAGTT 46man-26CTATCCGCGTCCAAGCCCTTGATGAACTTAGACGTCTTCTCGATCC 46man-27GGCTTCGACGCCGATAGAATGGTTTGTATTGGTGACGAAGGTTTTG 46man-28AACCATCGGAGTCAATATTCAAACCAAAACCTTCGTCACCAATACA 46man-29TTTGAATATTGACTCCGATGGTTCTTACCCATACCAATTCTCTGAA 46man-30ACGTTCATGCTAAAGTTCACACCTTCAGAGAATTCGTATGCGTAAG 46man-31GTCTGAACTTTACCATGAACCTAGGCATAGATACTATCGACTTTGG 46man-32AATCTCGATACAAGTGCAGAGTTCCAAAGTCGATAGTATCTATGCC 46man-33ACTCTGCACTTGTATCCAGATTCATGGGGTACGTCTGATGATTGGG 46man-34TCCATGAGCGGTGATCCAGCCATTACCCCAATCATCAGACGTACCC 46man-35TCCATCACCCCTCATGGAGCCGCCTCCAACGCAGCTCGTAAACCTT 46man-36ATGTTACACCGTATTCCTCCAACAAACAAGGTTTACCAGCTGCCTT 46man-37TG GAGGAATACGGTGTAACATCTAATCACTGTTCTGTGGAAGGTTC 46man-38TGGTAGACAAAGCAGTCTTCTGCCAAGAACCTTCCACAGAACAGTG 46man-39AGAAGACTGCTTTGTCTACCACTGGTGTGGGAGCTGATTTGTTTTG 46man-40AGTACTCAAATCGTCTCCGTACTGCCAAAACAAATCAGCTCCCACA 46man-4ITACGGAGACGATTTGAGTACTGGAAAGTCTCCCGATGATGGTAACA 46man-42ATAGTCGGAAGTACCGTAGTAAATTGTGTTACCATCATCGGGAGAC 46man-43TTTACTACGGTACTTCCGACTATCAGTGCTTGGTTACAGATCATGT 46man-44AGCAGAACCGATAGCTGCAACATGATCTGTAACCAAGCACman-45GGCCATTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGAACCGATAGCTGCAACAT利用套疊PCR的方法合成該重組P -甘露聚糖酶基因，設計的引物長度為40-50bp，相鄰兩引物之間有20bp左右重疊序列，Tm值為55-60°C。
2.一種表達重組甘露聚糖酶的基因工程菌GSl 15/MAN78 (Pichia sp GS115/MAN78,),保藏號 CCTCCNo:2012554。
3.—種重組甘露聚糖酶水解制備甘露寡糖的方法，其特征在于步驟為: 底物為含有甘露聚糖的瓜爾豆膠，或魔芋膠，或刺槐豆膠，或香豆膠，或田菁膠； 底物配制時，在溫度為50-55°C的自來水中一邊少量添加底物，同時一邊少量逐步添加重組甘露聚糖酶酶液，底物和酶量比例為Ig: 20ul，逐步遞增底物的量達到預定的濃度，均勻攪拌，無需調(diào)節(jié)PH; 水解底物濃度15% 40%質(zhì)量體積百分比，溫度為50-55°C，時間0.5_2h，水解完成后，將反應液進行離心去殘渣，取上清過濾，超濾，進行真空噴霧干燥，即得甘露低聚糖成品，降解物純度達90% ； 所加的重組甘露聚糖酶是利用權利要求2所述的保藏號CCTCCNo =2012554的基因工程菌GS115/MAN78表達制 備的粗酶液。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種重組甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制備甘露寡糖的方法，其步驟為1)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，優(yōu)化重組β-甘露聚糖酶基因；2)構建含有重組β-甘露聚糖酶基因的表達載體pHBM905BDM-Man，轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，培養(yǎng)驗證得單拷貝基因工程菌；3)構建培養(yǎng)驗證多拷貝的基因工程菌；4)用不同拷貝數(shù)的基因工程菌高效表達制備重組β-甘露聚糖酶；5)用重組β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖底物生產(chǎn)甘露寡糖，底物水解濃度15-40%，溫度50-55℃，時間0.5-2小時。目前，兩拷貝β-甘露聚糖酶基因工程菌GS115/MAN78(CCTCCNo2012554)表達水平較高。本發(fā)明重組β-甘露聚糖酶活性高達5000U/mL(DNS法)，水解底物特異性高，水解底物濃度明顯高于其他方法。
文檔編號C12N15/56GK103146724SQ20121059185
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權日2012年12月29日
發(fā)明者馬立新, 趙西選, 喻詩, 李曄星, 王亞平, 姚永蘭 申請人:湖北大學, 湖北花果山實業(yè)有限公司