添加鐵改善細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了在細(xì)胞培養(yǎng)物中增加細(xì)胞密度、存活性和/或效價的方法等，包括將含鐵組合物添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中的步驟。
【專利說明】添加鐵改善細(xì)胞培養(yǎng)
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年10月21日申請的美國臨時申請61/550，058的權(quán)益，其全文并入本文參考。
[0003]背景
[0004]哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中的常見問題是培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞死亡，其可由多種攻擊導(dǎo)致，例如營養(yǎng)物耗竭、抑制物建立和/或氧化應(yīng)激等等。通常并且特別對于利用哺乳動物培養(yǎng)系統(tǒng)的人們而言感興趣的是表達(dá)藥物學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物、在細(xì)胞培養(yǎng)過程中保持細(xì)胞存活性和/或延遲細(xì)胞死亡。已采用了一些方法以增加細(xì)胞培養(yǎng)物的存活性，例如應(yīng)用培養(yǎng)基添加劑和過表達(dá)抗凋亡基因。見例如Arden, et al.“Chemical caspase inhibitorsenhance cell culture viabilities and protein titer，，Biotechnol Prog.2007Mar_Apr;23(2):506-511;Mastrangelo, et al.“Antiapoptosis chemicals prolong productivelifetimes of mammalian cells upon Sindbis virus vector infection，，BiotechnolBioeng.1999Nov5;65 (3):298-305;Balcarcel, et al.uRapamycin Reduces HybridomaCell Death and Enhances Monoclonal Antibody Production，，Biotechnology and Bioengineering, 2001Vol.76，1-10;Zanghi et al.“The growth factor inhibitorsuramin reduces apoptosis and cell aggregation in protein-free CHO cell batchcultures.Biotechno 1.Prog.2000, 16, 319-325; Simpson, et al.“Prevention ofhybridoma cell death by bcl_2during suboptimal culture conditions，，BiotechnolBioengl997, 54:1-16;Singh,et al.“Enhancement of survivability of mammaliancells by overexpression of the apoptosis suppressor gene bcl_2.，，BiotechnolBioeng.1996, 52:166-175;Mastrangelo,et al.“Overexpression of bcl-2famiIymembers enhances survival of mammalian cells in response to variousculture insults.，，Biotechnology and Bioengineering, 2000，Vol67, 555-564 ; Arden,et al.“Inhibiting the apoptosis` pathway using MDM2in mammalian cellcultures.，，Biotechnology and Bioengineering, 2007; Vol.97，601-614)。然而，在一些情況中，應(yīng)用培養(yǎng)基添加劑可以延遲細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致較低細(xì)胞密度，因此較低產(chǎn)率。一些培養(yǎng)基添加劑可保護(hù)細(xì)胞免于在生長期凋亡，但是在死亡期無效。另外，大多數(shù)培養(yǎng)基添加劑很昂貴，其對于大規(guī)模藥物生產(chǎn)可能不實用。對于抗凋亡基因的過表達(dá)，基因轉(zhuǎn)染是挑戰(zhàn)，并且效果可能是依賴于不同個案的。
[0005]因此，需要改善細(xì)胞培養(yǎng)增加細(xì)胞存活性、密度和/或效價。
[0006]概述
[0007]本發(fā)明涵蓋了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即添加鐵、特別是高濃度的鐵到細(xì)胞培養(yǎng)基中可以顯著改善培養(yǎng)物的細(xì)胞密度、存活性和/或效價，還有其他益處。因此，本發(fā)明提供了改善細(xì)胞培養(yǎng)的有效但不昂貴以及容易的解決辦法。本發(fā)明在改善延長的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時的存活性中特別有用。
[0008]在一個方面，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度、存活性和/或效價的方法，包括步驟:提供在細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞以起始細(xì)胞培養(yǎng)過程(例如生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)過程)，及在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加含鐵組合物至所述細(xì)胞培養(yǎng)基，由此細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間增加。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述含鐵組合物可以選自多種含鐵化合物。在一些實施方案中，所述含鐵組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽(Fe-citrate)、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物(Fe-Chloride)、Fe-硝酸鹽(Fe-nitrate)、Fe-EDTA、Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3 及其組合。
[0010]在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括在整個細(xì)胞培養(yǎng)過程的時間點添加含鐵組合物。在一些實施方案中，含鐵組合物在第O天后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第I天或第I天之后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第3天或第3天之后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第6天或第6天之后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第9天或第9天之后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間多個時間點添加。
[0011]在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度(例如在一或多次加入含鐵組合物之后)范圍在100 μ M和5mM之間。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度范圍在300 μ M和ImM之間。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度是ImM。
[0012]本發(fā)明可以使用多種細(xì)胞類型。例如，在一些實施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞選自BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系、人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6)、猴腎細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞系(293)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠睪丸支持細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、犬腎細(xì)胞、buffalo大鼠肝細(xì)胞、人肺細(xì)胞、人肝細(xì)胞、小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞、TRI細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、FS4細(xì)胞或者人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(Hep G2)。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0013]在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是補料分批培養(yǎng)過程。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是分批-再流加培養(yǎng)過程(batch-refeedculture process)。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程 是灌注培養(yǎng)過程。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)過程。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基體積是至少大約500L。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行。
[0014]在一些實施方案中，加入補充蛋白質(zhì)以改善細(xì)胞培養(yǎng)密度、存活性和/或效價。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基不含水解物。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有水解物。
[0015]在一些實施方案中，細(xì)胞攜帶編碼重組蛋白的基因。在一些實施方案中，所述重組蛋白是抗體或其片段。在一些實施方案中，所述抗體是抗IL-22抗體。在一些實施方案中，所述抗體是抗GDF8抗體。在一些實施方案中，所述抗體是Myo29抗體。在一些實施方案中，所述抗體是單域抗體。在一些實施方案中，所述單域抗體是抗TNF納米抗體(nanobody)。在一些實施方案中，所述重組蛋白是糖蛋白。在一些實施方案中，所述重組蛋白是治療性蛋白。在一些實施方案中，所述治療性蛋白是抗體、生長因子、凝血因子、細(xì)胞因子、融合蛋白、藥物物質(zhì)、疫苗、酶或Small ModularlmmunoPharmaceutical?(SMIP) ?在一些實施方案中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括純化所述重組蛋白的步驟。
[0016]在另一方面，本發(fā)明提供了從根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白。
[0017]在另一方面，本發(fā)明提供了通過在細(xì)胞培養(yǎng)過程開始后一或多個時間點添加含鐵組合物而防止或延遲細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì) 胞死亡的方法。[0018]在另一方面，本發(fā)明提供了通過在細(xì)胞培養(yǎng)過程開始后一或多個時間點添加含鐵組合物而抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡的方法。
[0019]在一些實施方案中，所述含鐵組合物在第O天后添加。在一些實施方案中，所述含鐵組合物在第3天或第3天之后添加。在一些實施方案中，所述含鐵組合物在第6天或第6天之后添加。在一些實施方案中，所述含鐵組合物在第9天或第9天之后添加。
[0020]在一些實施方案中，鐵以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度范圍為100 μ M和5mM之間的量添加。在一些實施方案中，鐵以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度范圍為300 μ M和ImM之間的量添加。在一些實施方案中，鐵以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度為ImM的量添加。
[0021]在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是補料分批培養(yǎng)物。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是分批再流加培養(yǎng)物。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是灌注培養(yǎng)物。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)物。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是至少大約500L。在一些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物在搖瓶中進(jìn)行。
[0022]在一些實施方案中，所述含鐵組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其組合。
[0023]在另一方面，本發(fā)明提供了制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒，其包含一或多種用于制備初始細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑，以及單獨的含鐵組合物。在一些實施方案中，所述試劑盒包含在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間的一或多個時間點將所述單獨的含鐵組合物添加到所述初始細(xì)胞培養(yǎng)基中以例如增加細(xì)胞密度、存活性和/或效價的指導(dǎo)。
[0024]在一些實施方案中，所述單獨的含鐵組合物的量是實現(xiàn)在初始細(xì)胞培養(yǎng)基中鐵濃度范圍在100 μ M和5mM之間的量。在一些實施方案中，所述單獨的含鐵組合物的量是實現(xiàn)在至少500L的細(xì)胞培養(yǎng)物中鐵濃度范圍在100 μ M和5mM之間的量。
[0025]在一些實施方案中，所述單獨的`組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其組合。
[0026]在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于補料分批培養(yǎng)的補充成分。在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于分批再流加培養(yǎng)的補充成分。在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于灌注培養(yǎng)的補充成分。在一些實施方案中，所述補充成分選自激素和/或其他生長因子、無機離子、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂質(zhì)、葡萄糖或其他能量來源、及其組合。
[0027]在本申請中，“或者”的使用是指“和/或”，除非另有說明。如本申請所用，術(shù)語“包含”或其變化形式不意味著排除其它添加物、成分、整數(shù)或步驟。如本文所用，術(shù)語“大約(about)”和“大約(approximately)”等價使用。本申請中使用或未使用大約的任何數(shù)字是指覆蓋本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的任何正常波動。在一些實施方案中，術(shù)語“大約”是指數(shù)值范圍在任一方向(大于或小于)落入所述參考數(shù)值的25%，20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%或更小范圍的數(shù)值范圍，除非另有說明或者另外根據(jù)上下文是明顯的(除了當(dāng)這種數(shù)字超過可能值的100%)。
[0028]本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點在后面的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求書中顯而易見。但是應(yīng)理解所述詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求書當(dāng)指示本發(fā)明實施方案時，僅舉例示出而不是限制。本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化及修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
[0029]附圖簡述[0030]附圖僅舉例目的，不是限制。
[0031]圖1.舉例數(shù)據(jù)，證實3天后不同劑量的鐵添加對搖瓶中CHO細(xì)胞生長的作用。細(xì)胞生長測量為在給定時間點活細(xì)胞密度(VCD)(活細(xì)胞總數(shù)XlO6細(xì)胞/ml)。
[0032]圖2.舉例數(shù)據(jù)，證實3天后不同劑量的鐵添加對搖瓶中CHO細(xì)胞存活性的作用。存活性測量為在給定時間點培養(yǎng)物中(活細(xì)胞)/ (總細(xì)胞)百分比。
[0033]圖3.舉例數(shù)據(jù)，證實3天后不同劑量的鐵添加對搖瓶中CHO細(xì)胞的第16天存活性的作用。存活性測量為在給定時間點培養(yǎng)物中(活細(xì)胞)/ (總細(xì)胞)百分比。
[0034]圖4.舉例數(shù)據(jù)，證實3天后不同劑量的鐵添加對搖瓶中第16天的CHO細(xì)胞的抗體效價的作用。抗體效價測量為抗體克數(shù)/L培養(yǎng)基。抗體效價變化測量為在給定時間點[抗體]有鐵/[抗體]無鐵比率。
[0035]圖5.舉例數(shù)據(jù)，證實在添加ImM鐵至細(xì)胞系2培養(yǎng)過程后第14天的細(xì)胞密度、存活性和效價相對于對照的改善。細(xì)胞密度測量為在給定時間點活細(xì)胞總數(shù)XlO6細(xì)胞/ml。細(xì)胞密度改善表示為細(xì)胞密度1?/細(xì)胞密度5?的比率。存活性測量為在給定時間點培養(yǎng)物中(活細(xì)胞)/ (總細(xì)胞)的百分比。存活性改善測量為％存活性存活性5￡?的比率。抗體效價測量為抗體克數(shù)/L培養(yǎng)基。抗體效價變化測量為在給定時間點[抗體]We/[抗體]無鐵的比率。
[0036]圖6.舉例數(shù)據(jù)，證實3天后FeSO4或Fe-檸檬酸鹽添加(600 μ Μ)對搖瓶中細(xì)胞系I補料分批培養(yǎng)物的第14天存活性和活細(xì)胞密度的作用。活細(xì)胞密度測量為在給定時間點活細(xì)胞總數(shù)XlO6細(xì)胞/ml。活細(xì)胞密度改善表示為細(xì)胞密度細(xì)胞密度^^的比率。
[0037]圖7.舉例數(shù)據(jù)，證實第6天FeSO4添加(ImM)對搖瓶中補料分批培養(yǎng)物中生長的產(chǎn)生納米抗體的CHO細(xì)胞的細(xì)胞存活性的作用。
[0038]圖8.舉例數(shù)據(jù)，證實第6天FeSO4添加(ImM)對搖瓶中補料分批培養(yǎng)物中生長的產(chǎn)生納米抗體的CHO細(xì)胞的效價的作用。
[0039]圖9.舉例數(shù)據(jù)，證實第6天FeSO4添加(ImM)對搖瓶中補料分批培養(yǎng)物中生長的產(chǎn)生納米抗體的CHO細(xì)胞的總體產(chǎn)率的作用。
[0040]圖10.舉例數(shù)據(jù)，證實第6天FeSO4添加(ImM)對搖瓶中補料分批培養(yǎng)物中生長的產(chǎn)生納米抗體的CHO細(xì)胞的乳酸產(chǎn)量的作用。
[0041]圖11.舉例數(shù)據(jù)，證實FeSO4或Fe-檸檬酸鹽添加(600 μ M)對搖瓶中克隆2.8補料分批培養(yǎng)物的細(xì)胞密度的作用。
[0042]圖12.舉例數(shù)據(jù)，證實FeSO4或Fe-檸檬酸鹽添加(600 μ Μ)對搖瓶中克隆2.8補料分批培養(yǎng)物的存活性的作用。
[0043]圖13.舉例數(shù)據(jù)，證實FeSO4或Fe-檸檬酸鹽添加(600 μ Μ)對搖瓶中克隆2.8補料分批培養(yǎng)物的總體產(chǎn)率的作用。
[0044]圖14.舉例數(shù)據(jù)，證實不同劑量的第O天鐵添加對搖瓶中細(xì)胞系I的第3天存活性的作用。存活性測量為在給定時間點培養(yǎng)物中(活細(xì)胞)/ (總細(xì)胞)百分比。
[0045]詳細(xì)描述
[0046]本申請?zhí)峁┝送ㄟ^在細(xì)胞培養(yǎng)過程一或多個時間點添加含鐵組合物增加細(xì)胞密度、存活性和/或產(chǎn)物效價的方法和組合物等。本發(fā)明涵蓋令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加鐵可以延遲和/或防止細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞死亡。在一些實施方案中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加鐵可以抑制細(xì)胞培養(yǎng)物凋亡。
[0047]鐵是用于哺乳動物生長的細(xì)胞培養(yǎng)基的重要成分。但是，在本發(fā)明之前，認(rèn)為低鐵水平可以在鐵耗竭時抑制細(xì)胞生長，而高鐵水平可由于毒性(例如氧化應(yīng)激和自由基形成)而抑制細(xì)胞生長。因此，認(rèn)為鐵的有益和毒性性質(zhì)之間的平衡對于哺乳動物培養(yǎng)是重要的。在本發(fā)明之前，常規(guī)培養(yǎng)基配制品使用低濃度鐵以足夠支持細(xì)胞生長而同時保持在低于毒性鐵濃度水平。如實施例章節(jié)所述，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加鐵，包括被認(rèn)為是高濃度的鐵，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物的改善的細(xì)胞生長及延遲的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致顯著增加的細(xì)胞密度、存活性和效價等其他益處。這種作用不依賴于細(xì)胞系、規(guī)模、產(chǎn)物和鐵來源。另外，產(chǎn)物品質(zhì)不受高鐵濃度影響。因此，本發(fā)明提供了新的成本效益的方法用于改善的細(xì)胞培養(yǎng)。
[0048]本發(fā)明各個方面在下面章節(jié)中詳細(xì)描述。章節(jié)應(yīng)用不意味著限制本發(fā)明。每個章節(jié)可以適用于本發(fā)明任何方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些實施方案的各種修飾在所附權(quán)利要求書范圍內(nèi)。權(quán)利要求書及其等價物限定本發(fā)明范圍，其不是也不應(yīng)被限于某些實施方案的描述或者被其限制。
[0049]鐵鉬合物
[0050]本發(fā)明可以使用許多種含鐵組合物。在某些實施方案中，含鐵組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3及其組合。
[0051]本發(fā)明可以使用各種鐵濃度。典型地，鐵以大于“微量濃度”的濃度提供在培養(yǎng)基中。術(shù)語“微量濃度”在本文中是指可小于一般地或容易測量的水平的濃度。例如，化合物的微量水平可以是〈10_5，〈10_6，〈10_7或者〈101。在某些實施方案中，鐵以在大約100μΜ和5mM之間的濃度提供在培養(yǎng)基中(例如大約100 μ M - 4.5mM、100μΜ - 3.0mM, 100 μ M-
2.5πιΜ、100μΜ - 1.0mMUOOyM- 1.0πιΜ、200μΜ - 2.0πιΜ、200μ M- 1.5πιΜ、200μΜ - 1.0mM,150 μ M - 4.5mM、150 μ M - 3.5mM、150 μ M - 2.5mM、150 μ M - 1.5mM、150 μ M - 1.0mM,200 μ M - 1.5mM、200 μ M - 1.0mM,200 μ M - 2.5mM、300 μ M - 2.5mM、300 μ M - 1.5mM、300μΜ-2.0mM)o在某些實施方案中，鐵以如下濃度提供在培養(yǎng)基中:大約100μΜ、150 μ Μ、200 μ Μ、250 μ Μ、300 μ Μ、350 μ Μ、400 μ Μ、450 μ Μ、500 μ Μ、550 μ Μ、600 μ Μ、650 μ Μ、700 μ Μ、750 μ Μ、800 μ Μ、850 μ Μ、900 μ Μ、950 μ Μ、ImM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、
4.5mM或5mM，或者這些濃度內(nèi)的任何范圍。在某些實施方案中，鐵以大約300 μ M和ImM之間的濃度提供在培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度在細(xì)胞培養(yǎng)過程中增加。
[0052]本發(fā)明還涵蓋如下發(fā)現(xiàn)，即含鐵組合物可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間的任何時間點提供在培養(yǎng)基中。含鐵組合物可以通過在一段時間的一或多個時間點添加所述組合物而被加入以在培養(yǎng)基中實現(xiàn)希望的鐵濃度。在一些實施方案中，含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第O天或第O天之后添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第O天之后添加。在某些實施方案中，含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程(例如生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)過程)的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 天或第 O、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20天之后添加或者在上述時間點的任意組合時添加。在一些實施方案中，含鐵組合物在第3天或第3天之后添加。[0053]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于他或她的實驗設(shè)計的特定屬性在這些本發(fā)明范圍內(nèi)選擇精確的鐵濃度及添加時間，所述屬性包括待培養(yǎng)細(xì)胞的特征、被培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的任何產(chǎn)物(例如抗體或重組蛋白)的特征、細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中其它成分的存在與否以及生長條件。例如，靜態(tài)培養(yǎng)中生長的細(xì)胞比振蕩培養(yǎng)中生長的細(xì)胞可以或多或少地最佳利用鐵(見例如 W094/02592)。
[0054]細(xì)胞培養(yǎng)基
[0055]本文所用術(shù)語“培養(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”是指含有滋養(yǎng)生長的哺乳動物細(xì)胞的營養(yǎng)物的溶液。典型地，這種溶液提供了細(xì)胞最低生長和/或存活所需的必需及非必需氨基酸、維生素、能量來源、脂質(zhì)和微量元素。這種溶液也可以含有增強高于最低速率的生長和/或存活的補充成分，包括但不限于激素和/或其它生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸根)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低終濃度存在的無機化合物)、以高終濃度存在的無機化合物(例如鐵)、氨基酸、脂質(zhì)和/或葡萄糖或其它能量來源。在某些實施方案中，培養(yǎng)基被有利地配制成對于細(xì)胞存活和增殖最佳的pH和鹽濃度。在某些實施方案中，培養(yǎng)基是流加培養(yǎng)基(feed medium)，其在細(xì)胞培養(yǎng)開始后添加。
[0056]本發(fā)明可以使用許多種哺乳動物生長培養(yǎng)基。在某些實施方案中，細(xì)胞可以生長在多種化學(xué)成分確知的培養(yǎng)基(chemically defined media)中，其中培養(yǎng)基成分是已知及受控的。在某些實施方案中，細(xì)胞可以生長在復(fù)雜培養(yǎng)基中，其中不是所有培養(yǎng)基成分均是已知和/或受控的。
[0057]用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)成分確知的生長培養(yǎng)基在幾十年中已充分開發(fā)和公開。成分確知的培養(yǎng)基的所有成分均被很好鑒定，因此成分確知的培養(yǎng)基不含有復(fù)雜添加劑如血清或水解物。早期培養(yǎng)基配方被開發(fā)以允許細(xì)胞生長及維持存活性，很少或不考慮蛋白質(zhì)生產(chǎn)。最近，培養(yǎng)基配方被開發(fā)，明確目的是支持高產(chǎn)重組蛋白生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0058]復(fù)雜培養(yǎng)基不是所有成分均被很好鑒定，因此復(fù)雜培養(yǎng)基可含有添加劑如簡單和/或復(fù)雜碳源、簡單和/或復(fù)雜氮源和血清等。在一些實施方案中，適合于本發(fā)明的復(fù)雜培養(yǎng)基在本文所述成分確知的培養(yǎng)基的其它成分之外還含有添加劑如水解物。
[0059]在一些實施方案中，成分確知的培養(yǎng)基典型包括大概50種在水中已知濃度的化學(xué)實體。它們的大多數(shù)還含有一或多種良好鑒定的蛋白質(zhì)如胰島素、IGF-1、運鐵蛋白或BSA，但是其它則需要無蛋白質(zhì)成分，因此被稱為無蛋白質(zhì)的成分確知的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的典型化學(xué)成分落入5個大類:氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素和無法精確分類的雜類(amiscellaneous category that defies neat categorization)。
[0060]細(xì)胞培養(yǎng)基可任選用補充成分補充。本文所用術(shù)語“補充成分”是指增強生長和/或存活大于最低速率的成分，包括但不限于激素和/或其它生長因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸根)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂質(zhì)和/或葡萄糖或其它能量來源。在某些實施方案中，補充成分可以添加到初始細(xì)胞培養(yǎng)物中。在某些實施方案中，補充成分可以在細(xì)胞培養(yǎng)開始后添加。
[0061]典型地，微量元素是指以微摩爾或更低水平包括的多種無機鹽。例如，通常包括的微量元素是鋅、硒 、銅及其它。在一些實施方案中，鐵(亞鐵或鐵鹽)可以以微摩爾濃度作為微量元素被包括在初始細(xì)胞培養(yǎng)基中。如以上討論，本發(fā)明提供了方法，其包括在初始細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的微量鐵以外還添加鐵，從而細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度大于微量(例如大于100 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、800 μ Μ、900 μ M 或 ImM)。錳作為二價陽離子(MnCl2或MnSO4)也經(jīng)常包括在微量元素中，濃度范圍為納摩爾至微摩爾。許多不常見的微量元素通常以納摩爾濃度加入。
[0062]細(xì)朐
[0063]本發(fā)明可以使用能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的任何宿主細(xì)胞。在某些實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物的。本發(fā)明可以使用的哺乳動物細(xì)胞的非限制性例子包括BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(NS0/1，ECACC No:85110503);人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands);用 SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎 CVl 細(xì)胞系(C0S-7, ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞系(293或者亞克隆而用于懸浮培養(yǎng)生長的293細(xì)胞，Graham etal.，J.Gen Virol., 36:59, 1977);幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL10);中華倉鼠卵巢細(xì)胞+/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 77:4216，1980);小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4, Mather, Biol.Reprod.，23:243-251，1980);猴腎細(xì)胞(CVIATCC CCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HeLa，ATCC CCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL34) ;buffalo 大鼠肝細(xì)胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺細(xì)胞(W138, ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(Hep G2, HB8065);小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT060562, ATCC CCL51) ;TRI 細(xì)胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sc1.，383:44-68，1982) ;MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；及人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系OfeP G2)。
[0064]另外，任何數(shù)目的商業(yè)及非商業(yè)可獲得的雜交瘤細(xì)胞系可以用于本發(fā)明。本文所用術(shù)語“雜交瘤”是指得自永生化細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的融合的細(xì)胞或細(xì)胞后代。這種產(chǎn)生的雜交瘤是產(chǎn)生抗體的永生化細(xì)胞。用于產(chǎn)生雜交瘤的個體細(xì)胞可以來自任何哺乳動物來源，包括但不限于大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。在某些實施方案中，雜交瘤是三瘤細(xì)胞系，當(dāng)異源雜交(heterohybrid)骨髓瘤融合體(其是人細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系之間的融合產(chǎn)物)的后代隨后與漿細(xì)胞融合而產(chǎn)生。在某些實施方案中，雜交瘤是產(chǎn)生抗體的任何永生化雜種細(xì)胞系，例如 quadromas (見例如 Milstein et al.，Nature, 537:3053，1983)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解雜交瘤細(xì)胞系可以具有不同的營養(yǎng)需求和/或可以需要不同的培養(yǎng)條件用于最佳生長，并且能夠根據(jù)需要修改條件。
[0065]細(xì)胞培養(yǎng)方法
[0066]本文所用術(shù)語“培養(yǎng)物”及“細(xì)胞培養(yǎng)物”是指在適合細(xì)胞群存活和/或生長的條件下懸浮于培養(yǎng)基中的細(xì)胞群。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，在某些實施方案中，本文所用這些術(shù)語是指包含細(xì)胞群及細(xì)胞群所懸浮其中的培養(yǎng)基的組合。在某些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞包含哺乳動物細(xì)胞。
[0067]本發(fā)明可以使用適于希望過程(例如生產(chǎn)重組蛋白(例如抗體))的任何細(xì)胞培養(yǎng)方法。作為非限制性例子，細(xì)胞可以生長在分批或補料分批培養(yǎng)物中，其中在重組蛋白(例如抗體)足夠表達(dá)后終止培養(yǎng)，之后表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如抗體)被收獲。或者，作為另一個非限制性例子，細(xì)胞可以生長在分批-再流加或灌注培養(yǎng)物中，其中培養(yǎng)不終止，新的營養(yǎng)物和其它成分定期或連續(xù)加入到培養(yǎng)物中，在此期間定期或連續(xù)收獲表達(dá)的重組蛋白(例如抗體)。其它合適的方法(例如spin-tube培養(yǎng))是本領(lǐng)域已知的并且可以用于實施本發(fā)明。
[0068]在某些實施方案中，適用 于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)是補料分批培養(yǎng)。本文所用術(shù)語“補料分批培養(yǎng)”是指培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中在培養(yǎng)過程開始后的一個或多個時間將額外成分提供給培養(yǎng)物。這種提供的成分典型包含在培養(yǎng)過程期間已被耗竭的用于細(xì)胞的營養(yǎng)成分。另外或者替換地，這種額外成分可以包括本文所述補充成分。在某些實施方案中，額外成分提供在流加培養(yǎng)基中，如本文所述。補料分批培養(yǎng)典型地在某一點停止，收獲細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中的成分并任選純化。
[0069]在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)是分批-再流加培養(yǎng)。本文所用術(shù)語“分批-再流加”是指培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中細(xì)胞的一部分(例如大約50%、大約55%、大約60%、大約65%、大約70%、大約75%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%或更多的細(xì)胞)在接種及生長特定時間(例如I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天等)之后從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除。典型地，從分批-再流加移除的含細(xì)胞的培養(yǎng)基用等體積新鮮培養(yǎng)基置換。在某些實施方案中，額外成分提供在再流加培養(yǎng)基中，如本文所述。分批再流加培養(yǎng)典型是連續(xù)過程，其涉及培養(yǎng)容器(例如生物反應(yīng)器)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)增及維持。
[0070]在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)是灌注培養(yǎng)。典型地，灌注培養(yǎng)涉及通過使用細(xì)胞保留系統(tǒng)通過連續(xù)引入新鮮培養(yǎng)基及移除用過的培養(yǎng)基而保持工作體積細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實施方案中，細(xì)胞可以用任何可獲得的方法例如過濾、沉降、離心及其組合而保留在培養(yǎng)物中。在一些實施方案中，灌注培養(yǎng)物可以生長一段延長時間(例如2周、3周、4周、5周或更長)。[0071]細(xì)胞可以在技術(shù)人員選擇的任何方便體積中生長。例如，細(xì)胞可以在體積為幾毫升至幾升的小規(guī)模反應(yīng)容器中生長。或者，細(xì)胞可以在體積為大約至少I升至10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10，000、12，000升或更大或者在之間的任何體積的大規(guī)模商業(yè)
生物反應(yīng)器中生長。
[0072]細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度主要基于細(xì)胞培養(yǎng)物保持存活的溫度范圍及產(chǎn)生高水平希望產(chǎn)物(例如重組蛋白或抗體)的溫度范圍而選擇。例如，細(xì)胞系I在大約37°C生長良好并且可以產(chǎn)生高效價抗體。一般，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞在大約25°C至42°C的范圍內(nèi)生長良好并且可以產(chǎn)生希望產(chǎn)物(例如重組蛋白或抗體)，當(dāng)然本發(fā)明方法不限于這些溫度。某些哺乳動物細(xì)胞在大約35°C至40°C的范圍內(nèi)生長良好并且可以產(chǎn)生希望產(chǎn)物(例如重組蛋白或抗體)。在某些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的一或多個時間在20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45 °C 的溫度生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)細(xì)胞的特定需求及實施者特定生產(chǎn)需求選擇合適溫度生長細(xì)胞。根據(jù)實施者需求及細(xì)胞本身需求，細(xì)胞可以生長任何時間長度。
[0073]在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物可以進(jìn)行一或多次溫度轉(zhuǎn)變。當(dāng)轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物溫度時，溫度轉(zhuǎn)變可以是相對漸變的。例如，可以花費幾個小時或者幾天完成溫度變化。或者，溫度轉(zhuǎn)變可以是相對突然的。在培養(yǎng)過程中溫度可以穩(wěn)定升高或降低。或者，溫度可以在培養(yǎng)過程中各個時間以離散的量升高或降低。隨后的溫度或溫度范圍可以低于或高于初始或先前溫度或溫度范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解多個離散溫度轉(zhuǎn)變包含在本實施方案中。例如，溫度可以轉(zhuǎn)變一次(轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋蚋蜏囟然驕囟确秶?，細(xì)胞保持在這個溫度或溫度范圍一段時間，之后溫度可以再次轉(zhuǎn)變至新的溫度或溫度范圍，其可以是高于或低于先前的溫度或溫度范圍的溫度或溫度范圍。每次離散轉(zhuǎn)變后的培養(yǎng)物溫度可以是恒定的或者可以保持在一定溫度范圍內(nèi)。
[0074]在某些實施方案中，確定細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度、存活性和/或效價。本文所用術(shù)語“細(xì)胞密度”是指給定培養(yǎng)基體積中存在的細(xì)胞數(shù)目。本文使用術(shù)語“細(xì)胞存活性”是指培養(yǎng)物中細(xì)胞在給定培養(yǎng)條件集合或?qū)嶒炞兓律娴哪芰Α１疚乃眯g(shù)語也指在特定時間活細(xì)胞部分相對于該時間培養(yǎng)物中的活和死細(xì)胞總數(shù)的比例。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解確定細(xì)胞存活性的許多方法涵蓋在本發(fā)明中。例如，可以使用染料(例如臺盼藍(lán))，其不穿過活細(xì)胞膜，但是可以穿過死細(xì)胞或正在死亡細(xì)胞的被破壞的膜，從而確定細(xì)胞存活性。可以確定處于各種培養(yǎng)條件(例如鐵濃度或者培養(yǎng)時間)的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活性并且互相比較以確定這種培養(yǎng)物的最佳生長條件。本文所用術(shù)語“效價”是指例如在給定量的培養(yǎng)基體積中由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組表達(dá)的蛋白質(zhì)或抗體的總量。效價典型表示為每毫升培養(yǎng)基蛋白質(zhì)例如抗體的毫克單位。
[0075]在某些實施方案中，一旦通過實施者需求確定達(dá)到希望的細(xì)胞密度、存活性和/或效價，則終止分批和補料分批反應(yīng)。作為非限制性例子，一旦細(xì)胞達(dá)到最大活細(xì)胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 99%,則可以終止培養(yǎng)。另外或者替代地，可以在代謝廢物產(chǎn)物如乳酸和銨過量積累之前終止分批和補料分批反應(yīng)。在一些實施方案中，一旦廢物產(chǎn)物(如乳酸和/或銨)積累達(dá)到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多g/L培養(yǎng)基，則可以終止分批和補料分批反應(yīng)。
[0076]在某些情況中，在后續(xù)生產(chǎn)階段給細(xì)胞培養(yǎng)物補充已被細(xì)胞耗竭或代謝的營養(yǎng)物或其它培養(yǎng)基成分是有益的。作為非限制性例子，可以有益的是給細(xì)胞培養(yǎng)物補充激素和/或其它生長因子、無機離子(例如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸根)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素、水平高于微量濃度的無機化合物(例如鐵)、氨基酸、脂質(zhì)、或者葡萄糖或其它能量來源。這種補充成分可以一次全部加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，或者它們可以經(jīng)一系列添加而提供給細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0077]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)整具體細(xì)胞培養(yǎng)條件以優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)物的一些特征，包括但不限于生長速率、細(xì)胞存活性、細(xì)胞培養(yǎng)物的終細(xì)胞密度、有害代謝副產(chǎn)物如乳酸和銨的終濃度、希望產(chǎn)物(例如重組蛋白或抗體)的最終效價，或者這些的任何組合或者實施者認(rèn)為重要的其它條件。
[0078]蛋白質(zhì)表汰`
[0079]如上所述，在許多情況中，細(xì)胞被選擇或工程化以產(chǎn)生高水平希望產(chǎn)物(例如重組蛋白或抗體)。通常，細(xì)胞經(jīng)人工操作以產(chǎn)生高水平重組蛋白，例如通過導(dǎo)入編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因和/或通過導(dǎo)入調(diào)芐基因(內(nèi)源的或?qū)氲?表達(dá)的遺傳控制元件。
[0080]某些蛋白質(zhì)可能對細(xì)胞生長、細(xì)胞存活性或者其它一些細(xì)胞特征具有有害作用，最終以某一方式限制感興趣蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。即使在工程化表達(dá)特異蛋白質(zhì)的一種特定類型的細(xì)胞群中，差異也存在于該細(xì)胞群中，由此某些個體細(xì)胞生長更好，產(chǎn)生更多感興趣蛋白質(zhì)，或者產(chǎn)生具有更高活性水平(例如酶活性)的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，細(xì)胞系由實施者憑經(jīng)驗選擇用于在選擇用于培養(yǎng)細(xì)胞的特定條件下的強壯生長。在一些實施方案中，基于細(xì)胞生長、最終細(xì)胞密度、細(xì)胞存活性百分比、表達(dá)蛋白質(zhì)的效價或者這些的任何組合或?qū)嵤┱哒J(rèn)為重要的其它條件，選擇工程化表達(dá)特定蛋白質(zhì)的個體細(xì)胞用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0081]在宿主細(xì)胞中可表達(dá)的任何蛋白質(zhì)均可以根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)。本文所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指根據(jù)本發(fā)明被操作以生產(chǎn)本文所述感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。蛋白質(zhì)可以從宿主細(xì)胞內(nèi)源的基因表達(dá)，或者從導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的異源基因表達(dá)。蛋白質(zhì)可以是天然發(fā)生的，或者可以具有人工工程化或選擇的序列。
[0082]可以根據(jù)本發(fā)明被希望地表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常基于感興趣或有用的生物學(xué)或化學(xué)活性選擇。例如，本發(fā)明可以用于表達(dá)任何藥物學(xué)或商業(yè)相關(guān)的酶、受體、抗體、激素、調(diào)節(jié)因子、抗原、結(jié)合劑等。在一些實施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)選自抗體或其片段、納米抗體、單域抗體、糖蛋白、治療性蛋白、生長因子、凝血因子、細(xì)胞因子、融合蛋白、藥物物質(zhì)、疫苗、酶或者Small Modular ImmunoPharmaceuticals?(SMIPs)。可以根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白質(zhì)列表僅僅是舉例性的，不意味著是限制性引用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以根據(jù)本發(fā)明表達(dá)任何蛋白質(zhì)，并且能夠基于他或她的特定需求選擇要生產(chǎn)的特定蛋白質(zhì)。
[0083]抗體
[0084]鑒于目前大量抗體作為藥物或其它商業(yè)制劑在使用或研究，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)抗體是特別感興趣的。抗體是具有特異性結(jié)合特定抗原的能力的蛋白質(zhì)。可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何抗體均可以根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)。在一些實施方案中，待表達(dá)抗體是單克隆抗體。
[0085]在一些實施方案中，所述單克隆抗體是嵌合抗體。嵌合抗體含有衍生自一種以上生物體的氨基酸片段。嵌合抗體分子可包括例如來自小鼠、大鼠或其它物種的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人恒定區(qū)。各種制備嵌合抗體的方法已被描述。見例如 Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 6851 (1985) ; Takeda etal., Nature314, 452 (1985), Cabilly et al.,美國專利 4，816，567; Boss et al.,美國專利4，816，397; Tanaguchi et al.,歐洲專利公開EP171496;歐洲專利公開0173494，英國專利 GB2177096B。
[0086]在一些實施方案中 ，所述單克隆抗體是人抗體，例如通過使用核糖體展示或噬菌體展示文庫(見例如Winter et al.,美國專利6，291，159和Kawasaki,美國專利5，658，754)或者使用異種(xenographic)物種衍生,其中天然抗體基因被失活并且用人抗體基因功能性置換，同時完整留下天然免疫系統(tǒng)的其它成分(見例如Kucherlapati etal.,美國專利 6，657，103)。
[0087]在一些實施方案中，所述單克隆抗體是人源化抗體。人源化抗體是嵌合抗體，其中大部分氨基酸殘基衍生自人抗體，由此當(dāng)輸送給人對象時使任何潛在免疫反應(yīng)最小化。在人源化抗體中，互補決定區(qū)的氨基酸殘基被至少部分用來自非人物種的殘基置換，賦予希望的抗原特異性或親和性。這種改變的免疫球蛋白分子可以通過任何幾種現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)制備(例如Teng et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,80, 7308-7312(1983);Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983);Olsson etal.，Meth.Enzymo1.，92，3-16 (1982))，優(yōu)選根據(jù) PCT 公開 W092/06193 或 EP0239400 的教導(dǎo)制備，所有文獻(xiàn)并入本文參考。人源化抗體可以通過例如Scotgen Limited, 2HollyRoad, Twickenham, Middlesex, Great Britain 商業(yè)化產(chǎn)生。作為進(jìn)一步參考，參見 Joneset al., Nature321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-329(1988);和Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)，所有文獻(xiàn)并入本文參考。
[0088]在一些實施方案中，上述單克隆、嵌合或人源化抗體可以含有不是天然存在于自然界任何物種的任何抗體中的氨基酸殘基。這些外來殘基可以用于例如賦予單克隆、嵌合或人源化抗體新的或修飾的特異性、親和性或效應(yīng)物功能。在一些實施方案中，上述抗體可以綴合于用于系統(tǒng)性藥物治療的藥物，如毒素、低分子量細(xì)胞毒性藥物、生物學(xué)應(yīng)答修飾劑和放射性核素(見例如Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrierconiugates, US20040082764A1)。
[0089]在一些實施方案中，本發(fā)明用于產(chǎn)生特異性結(jié)合淀粉樣前體蛋白的Αβ片段或者淀粉樣斑的其它成分的抗體，可用于對抗特征為阿爾茨海默病的淀粉樣斑在腦中的積累(見例如美國臨時申請60/636，684)。在一些實施方案中，本發(fā)明用于產(chǎn)生特異性結(jié)合HER2/neu受體的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明用于產(chǎn)生抗⑶20抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明用于產(chǎn)生抗 TNF a、CD52、CD25、VEGF、EGFR、CDlla、CD33、CD3、IL-22, alpha-4整聯(lián)蛋白和/或IgE的抗體。
[0090]在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體針對在增生性疾病如癌癥中的靶細(xì)胞和/或組織上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。在一個實施方案中，所述抗體是IgGl抗Lewis Y抗體。LewisY 是碳水化合物抗原，具有結(jié)構(gòu)Fuc^l — 2GalBl -^4[Fuc4l^-3]GlcNacBI^3R' (Abeet al.(1983) J.Biol.Chem.，25811793-11797)。Lewis Y抗原在 60%_90% 的人上皮腫瘤(包括乳腺、結(jié)腸、肺和前列腺的腫瘤)表面上表達(dá)，其中至少40%過表達(dá)此抗原，在正常組織中有限表達(dá)。
[0091]為了靶向Ley及有效靶向腫瘤，理想需要具有對抗原的絕對特異性的抗體。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗Lewis Y抗體不與I型結(jié)構(gòu)(即血型的乳糖系列(Lea和Leb))交叉反應(yīng)，及優(yōu)選地不結(jié)合其它2型表位(即新乳糖結(jié)構(gòu))如Lex和H型2結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的抗 Lewis Y 抗體的例子稱為 hu3S193 (見美國專利 6，310，185; 6，518，415; 5，874，060，全文并入本文)。通過來自3S193的CDR移植產(chǎn)生人源化抗體hu3S193(Attia，M.A.，etal.1787-1800), 3S193是針對腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體，具有對于Ley的非常強的特異性(Kitamura，K.，12957-12961)。Hu3S193不僅保留了 3S193對Ley的特異性，而且獲得了介導(dǎo)補體依賴性細(xì)胞毒性(以下稱為CDC)和抗體依賴性細(xì)胞毒性(以下稱為ADCC)的能力(Attia，M.A.，et al.1787-1800)。這個抗體靶向裸鼠中表達(dá)Ley的異種移植物，這由使用hu3S193的生物分布研究證實，所述hu3S193用1251、IllIn或18F及其它需要螯合劑的放射標(biāo)記如 lllIn、99mTc 或 90Y 標(biāo)記(Clark, et al.4804-4811)。
[0092]在一些實施方案中，所述抗體是稱為Myo29、Myo28和Myo22的人抗⑶F_8抗體及其衍生的抗體和抗原結(jié)合片段之一。這些抗體能以高親和性結(jié)合成熟⑶F-8，體外和體內(nèi)抑制⑶F-8活性，例如通過抑制ActRIIB結(jié)合和報道基因測定所證實，以及可抑制與骨骼肌質(zhì)量和骨密度的負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-8活性。見例如Veldman，et al,美國專利申請20040142382。
[0093]受體
[0094]已顯示作為藥物和商業(yè)物質(zhì)有效的另一類多肽包括受體。受體是典型的跨膜糖蛋白，通過識別胞外信號傳導(dǎo)配體而起作用。受體典型具有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域及配體識別結(jié)構(gòu)域，其當(dāng)結(jié)合配體時通過磷酸化靶胞內(nèi)分子而起始信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育或代謝變化。在一個實施方案中，感興趣受體被修飾以除去跨膜和/或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，任選可附著Ig結(jié)構(gòu)域而代替其。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的受體是受體酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包 括對于多種功能多種細(xì)胞類型關(guān)鍵的受體(見例如Yardenand Ullrich, Ann.Rev.Biochem.57:433-478,1988;Ullrich and SchlessingerjCell61:243-254, 1990,并入本文參考)。RTK的非限制性例子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體家族成員、表皮生長因子受體(EGF)家族成員、血小板衍生生長因子(PDGF)受體、具有免疫球蛋白和EGF同源結(jié)構(gòu)域-1的酪氨酸激酶(TIE-1)和TIE-2受體(Sato etal.，Nature376 (6535): 70-74 (1995)，并入本文參考)及c-Met受體，其中一些已提示直接或間接促進(jìn)血管發(fā)生(Mustonen and Alitalo, J.Cell Biol.129:895-898，1995) JTK 的其它非限制性例子包括胎肝激酶I (FLK-1)(有時稱為含激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR) (Termanet al.，0ncogene6:1677-83，1991)或者血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2 (VEGFR-2))，fms 樣酪氨酸激酶-1 (Flt-1) (DeVries et al.Science255; 989-991，1992; Shibuya etal.,0ncogene5:519-524, 1990)，有時稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體I (VEGFR-1)，神經(jīng)氈蛋白-1，內(nèi)皮糖蛋白，內(nèi)皮唾液酸蛋白和Axl。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)的其它受體。
[0095]在一些實施方案中，呈腫瘤壞死因子α和β受體(TNFR-1;EP417，563，1991年3月20日公開；TNFR-2，EP417，014，1991年3月20日公開)形式的腫瘤壞死因子抑制物根據(jù)本發(fā)明表達(dá)(綜述見 Naismith and Sprang, J Inf lamm.47 (1-2): 1-7 (1995-96),并入本文參考)。根據(jù)一個實施方案，腫瘤壞死因子抑制物包含可溶性TNF受體及優(yōu)選地TNFR-1g。在一些實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的TNF抑制物是TNFRI和TNFRII的可溶形式，以及可溶性TNF結(jié)合蛋白，在另一實施方案中，TNFR-1g融合物是TNFR:Fe，該術(shù)語本文用來指〃依坦西普(etanercept)",其是兩個分子的p75TNF_a受體胞外部分的二聚體,每個分子由人IgGl的235個氨基酸Fe部分組成。
[0096]生長因子及其它信號傳導(dǎo)分子
[0097]已顯示作為藥物和商業(yè)物質(zhì)有效的另一類多肽包括生長因子及其它信號傳導(dǎo)分子。生長因子包括由細(xì)胞分泌的糖蛋白，其結(jié)合和激活其它細(xì)胞上的受體，起始受體細(xì)胞中的代謝或發(fā)育變化。在一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是ActRIIB融合多肽，包含ActRIIB受體的胞外結(jié)構(gòu)域和抗體的Fe部分(見例如Wolfman, et al., ActRIIB fusionpolypeptides and uses therefor, US2004/0223966A1 )0 在另一個實施方案中，所述生長因子可以是修飾的 GDF-8 前妝(見例如 Wolfman, et al., Modified and stabilized GDFpropeptides and uses the reof, US2003/0104406A1) ? 或者，感興趣蛋白質(zhì)可以是含有促卵泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(見例如Hill, et al., GASPl:a follistatin domaincontaining protein,US2003/0162714A1, Hill, et al., GASPl:a follistatin domaincontaining protein,US2005/0106154A1, Hill, et al., Follistatin domain containingproteins.US2003/0180306A1)。
[0098]哺乳動物生長因子及其它信號傳導(dǎo)分子的非限制性例子包括細(xì)胞因子；表皮生長因子(EGF);血小板衍生生長因子(TOGF);成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)如aFGF和bFGF ;轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β，包括 TGF-β 1、TGF_ β 2、TGF_ β 3、TGF_ β 4 或 TGF-β 5;胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-1UIGF-1和IGF-1 I) ;des (1-3)-1GF-1 (HfIGF-1),胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；⑶蛋白如⑶_3、⑶-4、⑶-8和⑶-19;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP);干擾素如干擾素-α、干擾素、干擾素-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(IL)，例如IL-1至IL-1O; IL-1O超家族細(xì)胞因子(例如IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26);腫瘤壞死因子(TNF) α和β ;胰島素A鏈；胰島素 B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體化激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C ;心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腦啡肽酶；RANTES(受激活調(diào)節(jié)正常 T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated on activation normally T-cell expressed andsecreted));人巨曬細(xì)胞炎性蛋白(ΜΙΡ_1_α ) ；mullerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白_4、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-5或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-6 (NT-3, NT-4, NT-5或NT-6)，或者神經(jīng)生長因子如NGF-β。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的其它生長因子或信號傳導(dǎo)分子。
[0099]G蛋白偶聯(lián)受體
[0100]已顯示作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)有效的另一類多肽包括生長因子及其它信號傳導(dǎo)分子。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在配體結(jié)合GPCR后，信號在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)或生理學(xué)性質(zhì)變化。
[0101 ] GPCR與G蛋白及效應(yīng)物(由G蛋白調(diào)節(jié)的胞內(nèi)酶和通道)一起是調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的成分，其連接胞內(nèi)第二信使的狀態(tài)與胞外輸入。這些基因及基因產(chǎn)物是潛在的疾病致病因子。
[0102]視紫質(zhì)基因和V血管加壓素受體基因中的特異性缺陷已示出導(dǎo)致多種形式的常染色體顯性及常染色體隱性遺傳色素性視網(wǎng)膜炎、腎性尿崩癥。這些受體對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍生理學(xué)過程均非常關(guān)鍵重要。GPCR蛋白超家族現(xiàn)含有250種以上類型的旁系同源物(paralogues)，代表由基因重復(fù)(或其它過程)產(chǎn)生的變體的受體，與來自不同物種的相同受體的直系同源物相反。該超家族可以分為5個家族:家族I，由視紫質(zhì)和β 2-腎上腺素能受體代表的受體，目前由200個以上獨特成員代表；家族II，最近鑒定的甲狀旁腺激素/降鈣素/分泌素受體家族；家族III，哺乳動物中的親代謝性谷氨酸受體家族；家族IV，cAMP受體家族，在盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum)的趨化性和發(fā)育中是重要的；家族V，真菌交配信息素受體如STE2。
`[0103]GPCR包括針對生物胺、炎癥的脂質(zhì)介導(dǎo)物、肽激素及感覺信號介導(dǎo)物的受體。當(dāng)受體結(jié)合其胞外配體時，GPCR變成激活的。由配體-受體相互作用導(dǎo)致的GPCR中的構(gòu)象變化影響G蛋白與GPCR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和性。這使得GTP以增強的親和性結(jié)合G蛋白。
[0104]GTP對G蛋白的激活導(dǎo)致G蛋白α亞基與腺苷酸環(huán)化酶或其它第二信使分子產(chǎn)生者相互作用。這種相互作用調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性及因此第二信使分子cAMP的產(chǎn)生。cAMP調(diào)節(jié)其它胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化及激活。或者，其它第二信使分子如cGMP或eicosinoids的細(xì)胞水平可以通過GPCR的活性上調(diào)或下調(diào)。G蛋白α亞基通過GTPase水解GTP而失活，α β和Y亞基重新締合。異源三聚體G蛋白然后從腺苷酸環(huán)化酶或其它第二信使分子產(chǎn)生者解離。GPCR活性也可以通過胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域或環(huán)的磷酸化而調(diào)節(jié)。
[0105]谷氨酸受體組成一組在神經(jīng)傳遞中重要的GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神經(jīng)遞質(zhì)，據(jù)信在神經(jīng)元可塑性、識別、記憶、學(xué)習(xí)及一些神經(jīng)性障礙如癲癇癥、中風(fēng)、神經(jīng)變性中具有重要作用(Watson, S.and S.Arkinstall (1994)The G-Protein Linked ReceptorFacts Book, Academic Press, San Diego CA, pp.130-132)。谷氨酸的這些作用由兩類受體介導(dǎo)，稱為離子型及促代謝型。離子型受體含有固有陽離子通道并且介導(dǎo)谷氨酸的快速興奮作用。促代謝型受體是調(diào)節(jié)性的，通過抑制鈣依賴性鉀傳導(dǎo)及抑制和增強離子型受體的興奮性傳遞而增加神經(jīng)元的膜興奮性。促代謝型受體基于激動劑藥理學(xué)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為5個亞型，廣泛分布于腦組織中。
[0106]血管活性腸多肽(VIP)家族是一組相關(guān)多肽，它們的作用也由GPCR介導(dǎo)。這個家族的關(guān)鍵成員是VIP本身、分泌素及生長激素釋放因子(GRF)。VIP具有廣譜生理學(xué)作用，包括松弛平滑肌、刺激或抑制多種組織中的分泌、調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞活性及在CNS中的多種興奮性和抑制性活性。分泌素刺激胰腺和小腸中酶和離子的分泌，也少量存在于腦中。GRF是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)，調(diào)節(jié)生長激素從垂體前葉的合成和釋放(Watson, S.and
S.Arkinstall supra, pp.278-283)。
[0107]在配體結(jié)合GPCR之后，構(gòu)象變化傳遞給G蛋白，其導(dǎo)致α亞基將結(jié)合的GDP交換為GTP分子并且與β Y亞基解離。α -亞基的GTP結(jié)合形式典型功能為效應(yīng)子調(diào)節(jié)部分，導(dǎo)致產(chǎn)生第二信使如環(huán)狀A(yù)MP (例如通過激活腺苷酸環(huán)化酶)、二酰基甘油或者磷酸肌醇。在人類中已知超過20種不同類型的α-亞基，其與較小集合的β和Y亞基締合。哺乳動物G蛋白的例子包括Gi, Go, Gq, Gs和Gt。G蛋白在Lodish H.et al.Molecular CellBiology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995)中充分描述，其內(nèi)容并入本文參考。
[0108]GPCR是藥物作用和開發(fā)的主要靶。事實上，受體已導(dǎo)致一半以上目前已知的藥物(Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516), GPCR 代表治療性介入最重要的祀，30% 臨床處方藥拮抗或激動 GPCR(Milligan，G.and Rees, S.，(1999) TIPS.20:118-124)。這證實這些受體具有作為治療祀的已建立證明的歷史。
[0109]一般，本發(fā)明實施者會選擇他們感興趣的多肽，知道其精確氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明待表達(dá)的任何給定蛋白質(zhì)具有其自己的特質(zhì)特性，可影響培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞密度或存活性，并且可以以低于在相同培養(yǎng)條件下生長的另一種多肽或蛋白質(zhì)的水平表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能合適修飾本發(fā)明的步驟和組合物以優(yōu)化細(xì)胞生長和/或任何給定表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
[0110]酶
[0111]已顯示作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)有效的另一類蛋白質(zhì)包括酶。酶可以是蛋白質(zhì)，其酶活性可以被產(chǎn)生它們的細(xì)胞培養(yǎng)條件影響。因此，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)具有希望酶活性的酶也是特別感興趣的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到許多已知的酶可以被培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)。
[0112]酶的非限制性例子包括糖酶如淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、戍聚糖酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚苷酶(naringanase)、果膠酶和支鏈淀粉酶；蛋白酶如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶(例如氨基肽酶和羧基肽酶)、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、胃前酯酶(pregastric esterase)、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亞氨基酰化酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶和青霉素酰化酶；異構(gòu)酶如葡萄糖異構(gòu)酶；氧化還原酶，如氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羥基類固醇脫氫酶或過氧化物酶；裂合酶如乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸脫羧酶、延胡索酸酶或組氨酸酶；轉(zhuǎn)移酶，如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；連接酶；幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、漆酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、果膠水解酶(pectinolytic enzyme)、多酹氧化酶、核糖核酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0113]一般，本發(fā)明實施者會選擇感興趣蛋白質(zhì)，知道其精確氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明待表達(dá)的任何給定蛋白質(zhì)可具有其自己的特定特性，可影響培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞密度或存活性，可以以低于在相同培養(yǎng)條件下生長的另一種蛋白質(zhì)的水平表達(dá)，及根據(jù)精確培養(yǎng)條件和進(jìn)行的步驟可以具有不同生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)能合適修飾用于生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)的步驟和組合物以優(yōu)化細(xì)胞生長和任何給定表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和/或活性。
[0114]將用于表達(dá)蛋白質(zhì)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞
[0115]一般，導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸分子編碼希望根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的蛋白質(zhì)。或者，核酸分子可編碼誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)希望蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物。例如，導(dǎo)入的遺傳材料可以編碼轉(zhuǎn)錄因子，激活內(nèi)源或異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。或者或另外，導(dǎo)入的核酸分子可增加細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的翻譯或穩(wěn)定性。
[0116]本領(lǐng)域已知適合將核酸導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞以實現(xiàn)感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。見例如 Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981;Mantei et al., Nature,281:40-46, 1979;Levinson et al.EP117, 060;EP117, 058，其均并入本文參考。對于哺乳動物細(xì)胞，將遺傳材料導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的常用方法包括Graham and van derErb (Virology, 52:456-457, 1978)的憐酸鈣沉淀法或者Hawley-Nelson (Focusl5:73，1993)的lipofectamine?(Gibco BRL)方法。哺乳動物宿主細(xì)胞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已由Axel在1983年8月16日頒發(fā)的美國專利號4，399，216中描述。對于將遺傳材料導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的各種技術(shù)見 Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methodsin Enzymology, 185:527-537, 1990 和 Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988。
[0117]在一些實施方案中，核酸可以以裸核酸分子形式導(dǎo)入。例如，導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子可以僅由編碼蛋白質(zhì)及必需的遺傳控制元件的核酸組成。或者，編碼蛋白質(zhì)的核酸(包括必需的調(diào)節(jié)元件)可以包含在`質(zhì)粒載體中。用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的合適載體的非限制性代表例子包括pCDNAl ;pCD,見Okayama, et al.Mol.CellBiol.5:1136-1142, 1985;pMClneo Poly-A,見 Thomas, et al.Cell51:503-512, 1987;桿狀病毒載體如 pAC373 或 pAC610;CDM8,見 Seed, B.Nature329:840，1987;及 pMT2PC,見Kaufman, et a 1.EMBO J.6:187-195，1987，其均全文并入本文參考。在一些實施方案中，待導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸分子包含在病毒載體中。例如，編碼蛋白質(zhì)的核酸可以插入病毒基因組(或部分病毒基因組)中。指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)元件可以包括在插入病毒基因組中的核酸中(即連接于插入病毒基因組的基因)或者可以由病毒基因組本身提供。
[0118]裸DNA可以通過形成含有DNA和磷酸鈣的沉淀而導(dǎo)入細(xì)胞中。或者，裸DNA也可以通過如下方式導(dǎo)入細(xì)胞:形成DNA與DEAE-葡聚糖的混合物及將混合物與細(xì)胞保溫或者將細(xì)胞與DNA —起在合適緩沖液中保溫并且將細(xì)胞進(jìn)行高壓電脈沖(例如通過電穿孔)。將裸DNA導(dǎo)入細(xì)胞的另一個方法是將DNA與含有陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體懸液混合。DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物然后與細(xì)胞保溫。裸DNA也可以通過例如顯微注射直接注射進(jìn)細(xì)胞。
[0119]或者，裸DNA也可以通過將DNA與偶聯(lián)于細(xì)胞表面受體的配體的陽離子如聚賴氨酸復(fù)合而導(dǎo)入細(xì)胞(見例如 Wu, G.and Wu, C.H.J.Biol.Chem.263:14621，1988;ffilson etal.J.Biol.Chem.267:963-967，1992;及美國專利5，166，320，其均全文并入本文參考)。DNA-配體復(fù)合物與受體的結(jié)合促進(jìn)DNA通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞而攝入。
[0120]使用含有特定核酸序列例如編碼蛋白質(zhì)的cDNA的病毒載體是將核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞的常用方法。用病毒載體感染細(xì)胞具有優(yōu)點，即大量細(xì)胞接受核酸，可以省略選擇已接受核酸的細(xì)胞的需要。另外，例如通過病毒載體中含有的cDNA編碼在病毒載體中的分子通常在攝入病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)。
[0121]缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒被良好鑒定用于基因治療目的的基因轉(zhuǎn)移(綜述見Miller，A.D.Blood76:271, 1990)。可以構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，將編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。另外，部分逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可以被除去以使逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制缺陷。這種復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒然后包裝成病毒粒，病毒粒可以用于通過使用輔助病毒經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)感染靶細(xì)胞。
[0122]腺病毒基因組可以被操作，從而其編碼及表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)但是其在正常裂解性病毒生命周期中的復(fù)制能力被失活。見例如Berkner et al.BioTechniques6:616, 1988;Rosenfeld et al.Science252:431-434，1991;及 Rosenfeld etal.Cell68:143-155, 1992。衍生自腺病毒毒株Ad5型dl324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合適腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。重組腺病毒是有利的，因為它們不需要分裂細(xì)胞成為有效的基因輸送運載體及可以用于感染許多種細(xì)胞類型，包括呼吸道表皮(Rosenfeld et al., 1992,如前述)，內(nèi)皮細(xì)胞(Lemarchand et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6482-6486, 1992),月干細(xì)胞(Herz and Gerard, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2812-2816, 1993)及肌肉細(xì)胞(Quantin et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:2581-2584, 1992)。另外，導(dǎo)入的腺病毒DNA (及其中含有的外來DNA)不整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，而是保持附加型的，從而避免在導(dǎo)入的DNA整合進(jìn)宿主基因組的情況中(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)由于插入誘變而可能發(fā)生的潛在問題。另外，腺病毒基因組攜帶外來DNA的能力相對于其它基因輸送載體更大(高達(dá)8kb) (Berkner et al.如前述；Haj-Ahmandand Graham, J.Virol.57:267, 1986)。目前使用的大多數(shù)復(fù)制缺陷型腺病毒載體被缺失了病毒El和E3基因的全部或部分，但是保留多達(dá)80%的腺病毒遺傳材料。
[0123]腺相關(guān)病毒(AAV)是天然發(fā)生的缺陷型病毒，其需要另一種病毒如腺病毒或皰疫病毒作為輔助病毒而進(jìn)行有效復(fù)制及生命周期(綜述見Muzyczka et al.Curr.Topicsin Micro, and Immunol.，158:97-129，1992)。其也是少數(shù)幾個可以將其DNA整合進(jìn)非分裂細(xì)胞并且展現(xiàn)高頻率穩(wěn)定整合的病毒之一(見例如Flotte et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356, 1992;Samulski et al., J.Virol.63:3822-3828,1989;和McLaughlin et al.，J.Virol.62:1963-1973，1989)。含有少至 300 個堿基對的 AAV 的載體可以被包裝并且可以整合。外源DNA的空間限于大約4.5kb。可以使用如Tratschinet al.(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260，1985)所述的 AAV 載體將 DNA 導(dǎo)入細(xì)胞中。許多種核酸已使用AAV載體導(dǎo)入不同細(xì)胞類型中(見例如Hermonat et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6466-6470，1984;Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081,1985;Wondisford et al., Mol.Endocrinol.2:32-39,1988;Tratschin et al.,J.Virol.51:611-619，1984;及 Flotte et al.，J.Biol.Chem.268:3781-3790，1993)。
[0124]當(dāng)用于將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞群的方法導(dǎo)致大比例細(xì)胞的修飾及蛋白質(zhì)由細(xì)胞有效表達(dá)時，修飾的細(xì)胞群可以無需進(jìn)一步分離或群體內(nèi)個體細(xì)胞的亞克隆而使用。即，細(xì)胞群可能足夠產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，從而無需進(jìn)一步細(xì)胞分離，細(xì)胞群可以立即用于接種細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。或者，從有效產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一些細(xì)胞或單個細(xì)胞分離及擴(kuò)增均質(zhì)細(xì)胞群可能是希望的。
[0125]代替將編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，導(dǎo)入的核酸可以編碼另一種多肽或蛋白質(zhì)，其誘導(dǎo)或增加由細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。例如，細(xì)胞可能表達(dá)特定蛋白質(zhì)，但是可能在不額外處理時就不能表達(dá)。類似地，細(xì)胞可表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的量對于希望目的不夠。因此，刺激感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)的物質(zhì)可以用于誘導(dǎo)或增加細(xì)胞對該蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，導(dǎo)入的核酸分子可編碼轉(zhuǎn)錄因子，其激活或上調(diào)感興趣蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。這種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)隨即導(dǎo)致感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)或更強表達(dá)。
[0126]在某些實施方案中，指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸穩(wěn)定導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。在某些實施方案中，指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸瞬時導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于他或她的實驗需求能選擇將核酸穩(wěn)定或瞬時導(dǎo)入細(xì)胞。
[0127]編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因可以任選與一或多個調(diào)芐基因控制元件連接。在某些實施方案中，基因控制元件指導(dǎo)蛋白質(zhì)組成型表達(dá)。在某些實施方案中，可以使用提供編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的誘導(dǎo)型表達(dá)的基因控制元件。誘導(dǎo)型基因控制元件(例如誘導(dǎo)型啟動子)的使用使得可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。潛在有用的用于真核細(xì)胞中的誘導(dǎo)型基因控制元件的非限制性例子包括激素調(diào)節(jié)元件(見例如Mader, S.and White, J.H.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5603-5607, 1993)、合成配體調(diào)節(jié)元件(見例如 Spencer, D.M.et al.，Science262:1019-1024, 1993)和電離輻射調(diào)節(jié)元件(見例如 Manome, Y.et al.，Biochemistry32:10607-10613，1993;DattajR.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10149-10153, 1992)。本領(lǐng)域已知的額外細(xì)胞特異性或其它調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以用于本發(fā)明。
[0128]根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇及任選合適修改導(dǎo)入基因的方法，使得細(xì)胞表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)。
[0129]表達(dá)的蛋白質(zhì)的分離
`[0130]一般，典型希望分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，因此作為純化過程第一步，細(xì)胞及其它固體可以通過如離心或過濾除去。
[0131]或者，表達(dá)的蛋白質(zhì)可以結(jié)合于宿主細(xì)胞表面。例如，可以除去培養(yǎng)基，裂解表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞作為純化過程的第一步。哺乳動物宿主細(xì)胞的裂解可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何手段進(jìn)行，包括用玻璃珠物理破壞或者暴露于高pH條件。
[0132]表達(dá)的蛋白質(zhì)可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離及純化，包括但不限于層析(例如離子交換、親和性、大小排阻和羥基磷灰石層析)、凝膠過濾、離心或差異可溶性、乙醇沉淀和/或通過純化蛋白質(zhì)的任何其它可利用技術(shù)(見例如Scopes, Protein PurificationPrinciples and Practice2nd Edition,Springer-Verlagj New York, 1987;Higgins, S.J.and Hames，B.D.(eds.), Protein Expression: A Practical Approach, OxfordUniv Press, 1999 ;和 Deutscher，M.P.，Simon, M.1.，Abelsonj J.N.(eds.)，Guideto Protein Purification: Methods in Enzymology(Methods in EnzymologySeriesjVol.182)，Academic Press, 1997，其均并入本文參考)。特別對于免疫親和性層析，蛋白質(zhì)可以通過其與包含抗體的親和柱結(jié)合而分離，所述抗體針對該蛋白質(zhì)而產(chǎn)生并且固定于固定支持物上。或者，親和性標(biāo)記如流感病毒外殼序列、聚組氨酸或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)附著于蛋白質(zhì)以使得容易通過合適親和柱而純化。蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑或抑肽酶可以在任何階段或全部階段被加入以降低或消除純化過程中的蛋白質(zhì)降解。當(dāng)細(xì)胞必須被裂解以分離和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)時，蛋白酶抑制劑是特別有利的。
[0133]本領(lǐng)域技術(shù)人員理解精確純化技術(shù)根據(jù)待純化蛋白質(zhì)的特征、表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的特征和/或細(xì)胞生長的培養(yǎng)基組成而變化。
[0134]藥物配制[0135]在本發(fā)明某些優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)具有藥物學(xué)活性，用于制備藥物。上述本發(fā)明組合物可以給予對象或者可以先配制以用于通過任何可利用途徑輸送，包括但不限于腸胃外(例如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、皮下、口服、鼻、經(jīng)支氣管、眼、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、直腸和陰道途徑。本發(fā)明藥物組合物典型包括表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)、輸送劑(即陽離子聚合物、肽分子轉(zhuǎn)運蛋白、表面活性劑等，如上述)及藥物學(xué)可接受載體。本文所用“藥物學(xué)可接受載體”包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，其與給藥相容。補充活性化合物也可以摻入組合物中。
[0136]藥物組合物被配制為與其給予途徑相容。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括下列成分:用于注射的無菌稀釋劑如水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或硫酸鹽；及用于調(diào)節(jié)張力的物質(zhì)如氯化鈉或右旋糖。PH可以用酸或堿調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制備物可以封裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑小瓶中。
[0137]適合注射使用的藥物組合物典型包括無菌水溶液(當(dāng)可溶于水時)或者分散液及用于即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。為靜脈內(nèi)給予，合適的載體包括生理鹽水、細(xì)菌抑制水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，組合物應(yīng)是無菌的并且應(yīng)該是能容易注射程度的流動的。優(yōu)選的藥物配制物在生產(chǎn)及儲存條件下是穩(wěn)定的，必須抗微生物如細(xì)菌和真菌污染作用而保存。一般，相關(guān)載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、乙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物。可以通過使用涂層如卵磷脂、在分散液情況中通過保持所需顆粒大小及通過使用表面活性劑而保持合適流動性。防止微生物作用可以通過各種抗細(xì)菌及抗真菌劑實現(xiàn)，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或者氯化鈉。注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁和明膠而實現(xiàn)。
[0138]無菌注射溶液可以通過將需要量的純化的多肽或蛋白質(zhì)與上述一種成分或成分組合根據(jù)需要摻入合適溶劑中制備，隨后過濾滅菌。通常，通過將表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上述所需其它成分的無菌運載體中而制備分散液。在制備無菌注射溶液的無菌粉末情況中，優(yōu)選制備方法是真空干燥及凍干，其產(chǎn)生來自先前無菌過濾溶液的活性成分加任何額外希望成分的粉末。
[0139]口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。為了口服治療給予，純化的多肽或蛋白質(zhì)可以摻入賦形劑并且以片劑、錠劑或膠囊劑例如明膠膠囊形式使用。口服組合物也可以用液體載體制備用作漱口水。藥物學(xué)相容粘合劑和/或佐劑材料可以包括作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以含有任何下述成分或者類似性質(zhì)的化合物:粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes ;助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或者芳香劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙味芳香劑。用于口服輸送的配制物可以有利地?fù)饺胛镔|(zhì)改善胃腸道內(nèi)穩(wěn)定性和/或增強吸收。
[0140]對于吸入給予，包含表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)及輸送劑的本發(fā)明組合物優(yōu)選以氣溶膠噴霧形式從含有合適推進(jìn)劑例如氣體如二氧化碳的加壓容器或分配器或霧化器輸送。本發(fā)明特別包括用鼻噴霧器、吸入器或者其它直接輸送至上和/或下氣道而輸送所述組合物。針對流感病毒的DNA疫苗的鼻內(nèi)給予已示出誘導(dǎo)⑶8T細(xì)胞應(yīng)答，表明當(dāng)以這種途徑輸送時呼吸道中至少一些細(xì)胞可以攝入DNA，本發(fā)明的輸送劑能增強細(xì)胞攝入。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，包含表達(dá)自哺乳動物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)及輸送劑的組合物配制為大的多孔顆粒用于氣溶膠給予。
[0141]全身給予也可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮裝置進(jìn)行。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給予，適于待滲透的屏障的滲透劑用于配制物中。這種滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，包括例如用于經(jīng)粘膜給予的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜給予可以通過使用鼻噴霧或栓劑實現(xiàn)。對于經(jīng)皮給予，純化的多肽或蛋白質(zhì)及輸送劑被配制成本領(lǐng)域通常已知的軟膏、油膏、凝膠或霜劑。
[0142]組合物也可以制備成栓劑形式(例如與常規(guī)栓劑基如可可油和其它甘油酯)或保留灌腸劑用于直腸輸送。
[0143]在一個實施方案中，組合物與載體一起制備，所述載體保護(hù)多肽或蛋白質(zhì)抗機體的快速清除，如控制釋放配制物，包括移植物及微囊輸送系統(tǒng)。可以使用生物降解生物相容聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類(polyorthoesters)及聚乳酸。制備這種配制物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。材料也可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.商業(yè)化獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括具有針對病毒抗原的單克隆抗體的靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥物學(xué)可接受載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法制備，例如如美國專利4，522，811所述。
[0144]有利的是配制口服或腸胃外組合物，呈易于給予和劑量均勻性的劑量單位形式。劑量單位形式在本文是指物理分離單位，適于作為單元劑量給予待治療對象；每個單位含有計算產(chǎn)生希望的治療效果的預(yù)定數(shù)量的活性多肽或蛋白質(zhì)，與所需的藥物學(xué)載體結(jié)合。
[0145]根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽或者蛋白質(zhì)可以以各種間隔在不同時間期間根據(jù)需要給予，例如每周一次，大約1-10周、2-8周、大約3-7周、大約4、5或6周等。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解某些因素可影響有效治療對象所需的劑量和時間，包括但不限于疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性、先前治療、對象的一般健康和/或年齡以及存在的其它疾病。通常，用本文所述多肽或蛋白質(zhì)治療 對象可以包括單次治療，或者在許多情況中可以包括一系列治療。另外應(yīng)理解合適劑量可依賴于多肽或蛋白質(zhì)的效力并且可以任選地針對特定受體而調(diào)整，例如通過給予增加劑量直至實現(xiàn)預(yù)選擇的希望應(yīng)答。應(yīng)理解針對任何特定動物對象的具體劑量水平可以依賴于各種因素，包括采用的具體多肽或蛋白質(zhì)的活性、對象的年齡、體重、一般健康、性別及飲食、給予時間、給予途徑、分泌速率、任何藥物組合及待調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性程度。
[0146]本發(fā)明包括本發(fā)明組合物用于治療非人動物的用途。因此，給藥劑量和方法可以根據(jù)獸藥學(xué)和醫(yī)學(xué)已知原則進(jìn)行選擇。可以在例如Adams, R.(ed.), VeterinaryPharmacology and Therapeutics, 81 edition, 1wa StateUniversityPress; ISBN:0813817439; 2001 中找到指導(dǎo)。
[0147]本發(fā)明的藥物組合物可以包括在容器、包裝或者分配器中，與給藥指導(dǎo)在一起。
[0148]試劑盒
[0149]本發(fā)明還提供了包括用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的成分的試劑盒，包括本文所述的含鐵組合物。這種試劑盒可以特別用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度、存活性和/或效價。
[0150]在一些實施方案中，本發(fā)明的這種試劑盒包括用于制備初始細(xì)胞培養(yǎng)基的一或多種試劑。這種試劑盒可以包括用于補充成分確知的細(xì)胞培養(yǎng)基的一或多種試劑(例如激素和/或其它生長因子；無機離子如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸根；緩沖劑；維生素；核苷或核苷酸；微量元素；氨基酸；脂質(zhì)；或者葡萄糖或其它能量來源)。本發(fā)明的試劑盒可以包括單獨的含鐵組合物(例如FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA,Fe (NO3) 3、FeCl2或者FeCl3X在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括單獨的含鐵組合物，其實現(xiàn)在本文所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的合適濃度(例如范圍在100μΜ和5mM之間)。本發(fā)明試劑盒還可以含有在本文所述細(xì)胞培養(yǎng)過程期間一或多個時間點將所述單獨的鐵組合物添加至初始細(xì)胞培養(yǎng)基的指導(dǎo)(例如用戶手冊)。
[0151]本發(fā)明試劑盒的成分可以提供在各個容器中，多個這種容器可以提供在一個共同外殼之中。
[0152]本發(fā)明通過下述非 限制性實施例更詳細(xì)描述。實施例的提供僅用于舉例，不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明范圍。
實施例
[0153]實施例1:在第3天后向補料分批培養(yǎng)物中添加Fe
[0154]本實驗證實在第3天后在生產(chǎn)治療性蛋白的細(xì)胞的補料分批培養(yǎng)期間添加Fe導(dǎo)致細(xì)胞密度、存活性和效價顯著增加。
[0155]CHO細(xì)胞、即細(xì)胞系I使用補料分批培養(yǎng)過程在化學(xué)成分確知的富集培養(yǎng)基(chemically defined enriched medium)中培養(yǎng)。在第3天后將高濃度Fe (例如100 μ M-5mM)加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中以實現(xiàn)不同F(xiàn)e濃度(例如0mM、0.1mM、1.0mM,2.0mM或5.0mM)。在這個實驗中，使用檸檬酸鐵，細(xì)胞在搖瓶中培養(yǎng)。在整個細(xì)胞培養(yǎng)過程的不同時間點進(jìn)行細(xì)胞的細(xì)胞密度、存活性和效價分析。
[0156]活細(xì)胞密度使用數(shù)字成像識別方法用CEDEX確定。在第3天后添加不同劑量Fe對舉例細(xì)胞系I的細(xì)胞生長的作用示于圖1。如圖1可見，與在鐵不存在下生長的細(xì)胞相比，在第3天后添加Fe增加了活細(xì)胞密度。
[0157]細(xì)胞存活性通過臺盼藍(lán)排除法經(jīng)CEDEX確定。在第3天后添加不同劑量Fe對舉例細(xì)胞系I的細(xì)胞存活性的作用示于圖2。如圖2所示，與在鐵不存在下生長的細(xì)胞相比，在第3天后添加Fe增加了細(xì)胞存活性。
[0158]另外，確定了 Fe添加對晚期細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞存活性的作用。具體地，在第16天確定在鐵存在或不存在下生長的細(xì)胞的細(xì)胞存活性。如圖3所示，添加Fe增加了第16天的細(xì)胞存活性。
[0159]還確定了在第3天后添加不同劑量Fe對抗體效價的作用。在第16天通過蛋白A親和性HPLC方法確定了在各種濃度鐵存在或不存在下生長的細(xì)胞的抗體效價。如圖4所示，添加Fe增加了第16天的抗體效價。
[0160]還觀測到最佳3天后Fe添加濃度很可能是0.在第3天后任一天添加Fe均是有效的。將Fe分配到多個補料可以比一次性添加更好。
[0161]在第2個舉例細(xì)胞系即細(xì)胞系2上進(jìn)行了類似實驗，舉例結(jié)果示于圖5。如圖5所示，添加Fe改善了細(xì)胞密度、存活性及效價，特別是在晚期。
[0162]除了 Fe-檸檬酸鹽，也測試了其它鐵復(fù)合物如FeSO4或Fe-運鐵蛋白的作用。圖6總結(jié)了舉例結(jié)果，示出在第3天后添加FeSO4或Fe-檸檬酸鹽對補料分批培養(yǎng)物的細(xì)胞系I第14天的活細(xì)胞密度及存活性的作用。
[0163]在搖瓶及生物反應(yīng)器中進(jìn)行了類似實驗，效果是相同的。這個效果對于不同產(chǎn)物(如不同的單克隆抗體)均觀測到。
[0164]因此，添加Fe的有益效果不依賴于細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模、Fe來源及產(chǎn)物。還確定了產(chǎn)物質(zhì)量不受高Fe濃度影響。
[0165]實施例2:在第6天添加Fe
[0166]表達(dá)納米抗體的CHO細(xì)胞在搖瓶中通過補料分批培養(yǎng)生長。細(xì)胞最初在7%C02溫箱中在37°C培養(yǎng)0-4天，在第4天后轉(zhuǎn)到31°C。在第6天加入FeSO4以實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基中鐵濃度為ImM。如實施例1所述，在細(xì)胞培養(yǎng)過程的不同時間點進(jìn)行細(xì)胞的細(xì)胞密度、存活性、效價、乳酸水平和Qp分析。舉例結(jié)果示于圖7-10。如圖7-10所示，添加Fe顯示在細(xì)胞培養(yǎng)期間的顯著益處，包括存活性改善(例如如圖7所示在第15天96%對70%)、效價改善(例如如圖8所示在第15天3.2g/L對1.5g/L)、Qp改善(例如如圖9所示20 μ g/e6/天對10 μ g/e6/天)以及乳酸水平降低(例如添加Fe的細(xì)胞培養(yǎng)物剩余乳酸接近0，而未添加Fe的對照培養(yǎng)物不是，其在第15天增至2.24g/L，如圖10所示)。
[0167]實施例3:在第O天添加Fe
[0168]設(shè)計這個實驗以測試在第O天添加高濃度Fe是否有有利效果。產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系(克隆2.8)的細(xì)胞在具有7%C02的pH受控?fù)u瓶中以~120rpm用軌道搖床培養(yǎng)。接種密度是1.5X106細(xì)胞/mL。細(xì)胞培養(yǎng)14天。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是補加氨基酸包括4mM谷氨酰胺的化學(xué)成分確知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。補料培養(yǎng)基是化學(xué)成分確知的濃縮補料培養(yǎng)基。在第O天或第9天添加Fe-檸檬酸鹽或者FeSO4以實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基中鐵濃度為600 μ Μ。如前述實施例所述，在細(xì)胞培養(yǎng)過程不同時間點將細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞密度、存活性、效價及Qp分析。舉例結(jié)果不于圖11_13。
[0169]在第O天添加Fe-檸檬酸鹽導(dǎo)致在細(xì)胞培養(yǎng)早期增加的細(xì)胞生長，而在第9天添加Fe顯示在細(xì)胞培養(yǎng)晚期改良的細(xì)胞密度(圖11)。但是，在第O天添加Fe-檸檬酸鹽似乎對于在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時保持較高存活性沒有幫助。例如，如圖12所示，在第O天添加600 μ MFe-檸檬酸鹽的細(xì)胞培養(yǎng)物第14天的存活性是大約75%，其與未添加Fe的對照培養(yǎng)物第14天的存活性74-80%相當(dāng)。相反，在第9天添加Fe的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞存活性是85_90%。
[0170]另外，如圖13所示，在第O天添加Fe-檸檬酸鹽的細(xì)胞培養(yǎng)物的Qp低于培養(yǎng)物所有其他條件。
[0171]在一些情況中，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)開始時添加Fe時，在高Fe濃度觀測到毒性。例如，在第O天將Fe添加到細(xì)胞系1，對搖瓶中第3天的細(xì)胞存活性的舉例作用示于圖14。如圖14可見，在高于100μ M的Fe濃度觀測到毒性。與實施例1和2的結(jié)果相比，令人驚奇地在第O天之后添加的高濃度Fe不僅沒有毒性，而且證實對細(xì)胞培養(yǎng)物的益處，包括細(xì)胞存活性和細(xì)胞生長。
[0172]等價物
[0173]本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過常規(guī)的實驗將認(rèn)識到或者能夠確定本文描述的本發(fā)明特異實施方案的許多等價物。本發(fā)明的范圍不限于上述描述，而是在所附權(quán)利要求書中限定。
[0174]在權(quán)利要求書中，冠詞“一個”和“所述”可以指一或多個，除非存在相反指示或者根據(jù)上下文很明顯。在一組的一或多個成員之間包括“或者”的權(quán)利要求或描述被認(rèn)為在給定產(chǎn)物或方法中存在、采用或者與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)的一個、一個以上或所有的組成員，除非有相反指示或者根據(jù)上下文很明顯。本發(fā)明包括這樣的實施方案，其中在給定產(chǎn)物或方法中存在、采用一個組成員或者一個組成員與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)。本發(fā)明包括這樣的實施方案，其中在給定產(chǎn)物或方法中存在、采用一個以上或所有的組成員或者一個以上或所有的組成員與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)。另外，應(yīng)理解本發(fā)明涵蓋所有變化、組合和交換，其中來自一或多個權(quán)利要求的一或多個限制、元件、從句、描述性術(shù)語等被引入另一權(quán)利要求。例如，依賴于另一個權(quán)利要求的任何權(quán)利要求可以被修飾以包括在依賴于相同基礎(chǔ)權(quán)利要求的任何其它權(quán)利要求中發(fā)現(xiàn)的一或多個限制。
[0175]當(dāng)元件一列表呈現(xiàn)時例如以馬庫什形式，應(yīng)理解也公開了元件的每個亞組，并且任意元件均可以從組中去除。應(yīng)理解通常當(dāng)發(fā)明或發(fā)明某些方面提及包含特定元件、特征等時，本發(fā)明的某些實施方案或本發(fā)明的方面由這種元件、特征等組成或者基本上由這種元件、特征等組成。為簡明，這些實施方案在本文不特異以特定書面方式限定。注意術(shù)語“包含”是開放式的并允許包括額外元`件或步驟。
[0176]當(dāng)給出范圍時，端點是包括在內(nèi)的。另外，應(yīng)理解除非另外指出或者另外根據(jù)上下文及本領(lǐng)域技術(shù)人員理解很明顯，在本發(fā)明不同的實施方案中表示為范圍的值可以假定是所述范圍內(nèi)的任何特定值或子范圍，至所述范圍底限的單位的十分之一，除非上下文另外清楚指出。
[0177]另外，應(yīng)理解落入現(xiàn)有技術(shù)的本發(fā)明任何特定實施方案可以從一或多個權(quán)利要求中明確排除。因為這種實施方案被視為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們可以被排除，即使排除未在本文明確描述。本發(fā)明組合物的任何特定實施方案(例如任何靶向部分、任何疾病、失調(diào)和/或病癥、任何連接劑、任何給予方法、任何治療應(yīng)用等)可以從一或多個權(quán)利要求中排除，為了任何原因，與現(xiàn)有技術(shù)存在是否相關(guān)。
[0178]提供上述討論的出版物及全文僅因為它們在本申請申請日之前公開。本文的任何內(nèi)容不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不在這種現(xiàn)有技術(shù)公開內(nèi)容之前。
[0179]并入?yún)⒖?br> [0180]本申請引用的所有出版物和專利文件均以其全文并入本文參考，如同每個出版物或?qū)＠募膬?nèi)容均并入本文一般。
【權(quán)利要求】
1.增加細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度、存活性和/或效價的方法，包括步驟: (a)提供在細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞以起始細(xì)胞培養(yǎng)過程'及 (b)在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間將含鐵組合物添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基，從而在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2, FeCl3 及其組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第O天之后添加。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第I天或第I天之后添加。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第3天或第3天之后添加。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程的第6天或第6天之后添加。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述含鐵組合物在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間的多個時間點添加。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在添加所述含鐵組合物后，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度范圍在100μΜ和5mM之間。`
9.權(quán)利要求1的方法，其中在添加所述含鐵組合物后，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度范圍在300 μ M和ImM之間。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在添加所述含鐵組合物后，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵濃度是ImM0
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞選自BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系、人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6)、猴腎細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞系(293)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠睪丸支持細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、犬腎細(xì)胞、buffalo大鼠肝細(xì)胞、人肺細(xì)胞、人肝細(xì)胞、小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞、TRI細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、FS4細(xì)胞或者人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(Hep G2)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是補料分批培養(yǎng)過程。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是分批-再流加培養(yǎng)過程。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是灌注培養(yǎng)過程。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)過程。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基的體積是至少大約500L。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基不含水解物。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有水解物。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞攜帶編碼重組蛋白的基因。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述重組蛋白是抗體或其片段。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體是抗IL-22抗體。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體是抗GDF-8抗體。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體是Myo29。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體是單域抗體。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述單域抗體是抗TNF納米抗體。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述重組蛋白是糖蛋白。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述重組蛋白是治療性蛋白。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述治療性蛋白是生長因子、凝血因子、細(xì)胞因子、融合蛋白、藥物物質(zhì)、疫苗、酶或 Small Modular ImmunoPharmaceutical?(SMIP) ?
31.權(quán)利要求21-30任一項的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括純化所述重組蛋白。
32.從根據(jù)權(quán)利要求21-31任一項的方法培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白。
33.防止或者延遲細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括在開始細(xì)胞培養(yǎng)過程后的一或多個時間點添加含鐵組合物的步驟。
34.抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡的方法，所述方法包括在開始細(xì)胞培養(yǎng)過程后的一或多個時間點添加含鐵組合物的步驟。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述含鐵組合物在第O天后添加。
36.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述含鐵組合物在第3天后添加。
37.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述含鐵組合物在第6天添加。
38.權(quán)利要求33或34的方法，其中鐵是以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度范圍在100μΜ和5mM之間的量添加。
39.權(quán)利要求33或34的方法，其中鐵是以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度范圍在300μ M和ImM之間的量添加。
40.權(quán)利要求33或34的方法，其中鐵是以實現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為ImM的量添加。
41.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)過程是補料分批培養(yǎng)過程。
42.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)是分批-再流加培養(yǎng)。
43.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)是灌注培養(yǎng)。
44.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)是大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的體積是至少大約500L。
46.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述含鐵組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3及其組合。
47.制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒，包含: (a)用于制備初始細(xì)胞培養(yǎng)基的一或多種試劑'及 (b)單獨的含鐵組合物； (C)在細(xì)胞培養(yǎng)過程期間的一或多個時間點將所述單獨的含鐵組合物添加到所述初始細(xì)胞培養(yǎng)基中以增加細(xì)胞密度、存活性和/或效價的指導(dǎo)。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述單獨的組合物的量是實現(xiàn)初始細(xì)胞培養(yǎng)基中鐵濃度范圍在100μΜ和5mM之間的量。
49.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述單獨的組合物的量是實現(xiàn)在至少500L的細(xì)胞培養(yǎng)物中鐵濃度范圍在100 μ M和5mM之間的量。
50.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述單獨的組合物選自FeS04、Fe-檸檬酸鹽、Fe-運鐵蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸鹽、Fe-EDTA, Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3 及其組合。
51.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述試劑盒還包含用于補料分批培養(yǎng)的補充成分。
52.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述試劑盒還包含用于分批-再流加培養(yǎng)的補充成分。
53.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述試劑盒還包含用于灌注培養(yǎng)的補充成分。
54.權(quán)利要求51-53任一項的試劑盒，其中所述補充成分選自激素和/或其它生長因子、無機離子、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂質(zhì)、葡萄糖或其它能量來源及其 組合。
【文檔編號】C12N5/00GK103890166SQ201280051721
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月21日
【發(fā)明者】W·王, Y-T·欒, D·德拉波, R·P·諾蘭 申請人:輝瑞公司