本發明涉及細胞培養基
技術領域：
，尤其涉及一種培養肝細胞的培養基及其制備方法。
背景技術：
：利用動物細胞培養技術來驗證化合物毒理學實驗測試目前為止最為高效和可行的方法。隨著生物技術在化合物毒理學安全評價應用領域和市場需求量的不斷擴大，提高動物細胞培養和毒理學試驗、延長維持時間以獲得可靠結果，成為優化動物細胞培養過程和毒理學實驗的核心。眾所周知，動物細胞培養及毒理學試驗的效果的經濟性和效率起決定性作用的是培養基，培養基的優化是建立高效的動物細胞培養和毒理學試驗過程的核心環節。因此，根據細胞在生長、代謝和毒理學試驗表達過程中的營養需求，設計動物細胞培養基中營養物的成分、含量和配比是工作的重要內容。國內外許多商業化的培養基—般由基礎培養基和血清或替代物組成，顯著影響細胞生長、代謝和毒理試驗現象表達這些培養基—般僅能確保細胞的穩定傳代，并不能較好地支持細胞生長和毒理試驗效果的表達，因而阻礙了細胞毒理學實驗的普及和應用。中國專利申請cn102311938a公開了一種用于肝細胞培養的無血清培養基，其包含基礎培養基和添加組分，其中，所述添加組分包括：胰島素0.1～10μg/ml、轉鐵蛋白0.5～10μg/ml、亞硒酸鈉5～10μg/l、表皮生長因子1～100ng/ml、肝細胞生長因子1～100ng/ml、纖粘連蛋白0.1～1μg/ml、地塞米松0.1～10nmol/ml和胰高血糖素0.05～5μg/ml。中國專利申請cn105087465a公開了一種肝細胞無血清培養基，其包括以下組分：基礎培養基500ml；絲膠蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/ml；肝細胞生長因子5～20ng/ml；表皮生長因子10～50ng/ml；青鏈霉素100u/ml，這些用于肝細胞培養的無血清培養基，但是，存在價格昂貴，不利于日常應用、廣泛推廣及肝細胞的產業化培養等問題。市售的商業無血清培養基在血清替代方面多具有良好的表現，但在支持細胞培養和高效表達毒理學效果方面仍有諸多缺陷。因此，在進行動物細胞培養和毒理學實驗時，多數無血清培養基難以充分、平衡地向細胞提供所需的營養物質。培養基利用率很低，造成極大的浪費。技術實現要素：針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種培養肝細胞的培養基，本發明提供的培養肝細胞的培養基不含有胎牛血清，不含任何動物來源成份，能提供細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境。為解決上述問題，本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2～10mg/l，硫辛酸30～100μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.9-1.3mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸2～7μg/l，纖粘連蛋白14-22μg/l、脂質型牛血清蛋白180～420mg/l，2-巰基乙醇10～60μg/l，雷帕霉素3～12μg/l，葉酸3～9μg/l，黃體酮0.2～1.6mg/l，微量元素5～23μg/l，細胞生長因子20-35μg/l。優選的，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5～8mg/l，硫辛酸42～82μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.9-1.3mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸3～6μg/l，纖粘連蛋白15～18μg/l、脂質型牛血清蛋白240～360mg/l，2-巰基乙醇25～42μg/l，雷帕霉素5～8μg/l，葉酸4～7μg/l，黃體酮0.7～1.3mg/l，微量元素5～23μg/l，細胞生長因子20-35μg/l。本發明提供的培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，基礎培養基能夠提供肝細胞的生存和最低的生理活動。膽固醇作為一種脂類，參與形成細胞膜，硫辛酸與本發明所用其他原料協同作用，能夠提高肝細胞的細胞活率，另外，硫辛酸還起到抗氧化的作用，過氧化氫酶能夠清除自由基，保護肝細胞免受超氧自由基損害等，胰島素可通過作用于肝細胞表面的胰島素受體，增強肝細胞對能源的攝入和利用，同時促進肝細胞內的rna、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，從而增強肝細胞的活力與功能，纖粘連蛋白能夠促進肝細胞的黏附，及其貼壁生長，硫酸軟骨素能增加細胞的信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成以及具有促進細胞代謝的作用，與其他原料配合使用，能夠達到更好的提高肝細胞的增殖倍數和細胞活率的效果。本發明對基礎培養基的種類沒有特殊的要求，可以為本領域技術人員所常知，例如，所述基礎培養基為f12或rmpi1640培養基。細胞生長因子能夠促進肝細胞的增殖，以及調節肝細胞的功能。優選的，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:(1.2～3.6)。優選的，本發明的培養基中還含有微量元素，所述微量元素為微量金屬元素和/或維生素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣中的至少一種。優選的，所述維生素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2、維生素b5、維生素b6、維生素b12、維生素b13、維生素b15、對氨基苯甲酸中的至少一種。優選的，所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、核糖、脫氧核糖中的至少一種。一種培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至6.7-7.3，在溫度為35～38℃、二氧化碳濃度為5～60ml、濕度為60～85％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用微米濾膜過濾，除菌后，即得。優選的，所述微米膜為孔徑為0.1～0.3微米的濾膜。與現有技術相比，本發明具有以下技術效果：本發明的培養肝細胞的培養基化學成分明確，在本發明的培養基中，干細胞生長良好，細胞形態、密度與含有血清的培養基相當，且細胞功能和活力明顯優于含血清培養基，克服了傳統含血清培養基的缺陷；本發明培養肝細胞的培養基搭配合理，各成分間協同作用，能提供細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境，促進肝細胞的增殖，提高肝細胞的細胞活率。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例1本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基f12培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇6mg/l，硫辛酸60μg/l，硫酸軟骨素0.3g/l，抗生素15μm，胰島素1.2mg/l，過氧化氫酶14mg/l，全反式維甲酸4μg/l，纖粘連蛋白16μg/l、脂質型牛血清蛋白300mg/l，2-巰基乙醇30μg/l，雷帕霉素6μg/l，葉酸5μg/l，黃體酮1.0mg/l，微量元素15μg/l，細胞生長因子30μg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:2。所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳；所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤；本發明還提供了該培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至7.0，在溫度為36℃、二氧化碳濃度為40ml、濕度為70％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用孔徑為0.2微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例2本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基rmpi1640培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5mg/l，硫辛酸42μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素13μm，胰島素0.9mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸3μg/l，纖粘連蛋白15μg/l、脂質型牛血清蛋白240mg/l，2-巰基乙醇25μg/l，雷帕霉素5μg/l，葉酸4μg/l，黃體酮0.7mg/l，微量元素5μg/l，細胞生長因子20μg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:1.2。所述微量元素鐵、銅、維生素a、維生素d；所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶；本發明還提供了該培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至6.7，在溫度為35℃、二氧化碳濃度為5ml、濕度為60％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例3本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基f12培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇8mg/l，硫辛酸82μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素16μm，胰島素1.3mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸6μg/l，纖粘連蛋白18μg/l、脂質型牛血清蛋白360mg/l，2-巰基乙醇42μg/l，雷帕霉素8μg/l，葉酸7μg/l，黃體酮1.3mg/l，微量元素23μg/l，細胞生長因子35μg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:3.6。所述微量元素為維生素，所述維生素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2；所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤；本發明還提供了該培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至7.3，在溫度為38℃、二氧化碳濃度為60ml、濕度為85％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用孔徑為0.3微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例4本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基f12培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2mg/l，硫辛酸30μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素13μm，胰島素0.9mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸2μg/l，纖粘連蛋白14μg/l、脂質型牛血清蛋白180mg/l，2-巰基乙醇10μg/l，雷帕霉素3μg/l，葉酸3μg/l，黃體酮0.2mg/l，微量元素5μg/l，細胞生長因子20μg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:1.2。所述微量元素為鉻、硒、碘、鎳；所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶；本發明還提供了該培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至6.7，在溫度為35℃、二氧化碳濃度為5ml、濕度為60％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實施例5本發明提供了一種培養肝細胞的培養基，包括基礎培養基rmpi1640培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇10mg/l，硫辛酸100μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素16μm，胰島素1.3mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸7μg/l，纖粘連蛋白22μg/l、脂質型牛血清蛋白420mg/l，2-巰基乙醇60μg/l，雷帕霉素12μg/l，葉酸9μg/l，黃體酮1.6mg/l，微量元素23μg/l，細胞生長因子35μg/l；所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子組成，所述細胞生長因子由表皮生長因子和肝細胞生長因子的重量比為1:3.6。所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2、維生素b5、維生素b6；所述添加劑中還含有：l-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤；本發明還提供了該培養肝細胞的培養基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎培養基中加入膽固醇，硫辛酸，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質型牛血清蛋白，2-巰基乙醇，雷帕霉素，葉酸，黃體酮，微量元素，細胞生長因子，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調節ph至7.3，在溫度為38℃、二氧化碳濃度為60ml、濕度為85％的條件下培養2周；(3)將步驟(2)的產物用孔徑為0.3微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實驗方法:(1)將新鮮分離的大鼠肝細胞，分別用實施例1～5和對比例1的無血清培養基和含10％(v/v)胎牛血清(fbs)的william’s-e培養基將細胞重懸，調整細胞濃度到1×106cells/ml，然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養玻璃皿中，置于搖動搖床上，速度為10cpm，在培養24小時，48小時和72小時取樣，分析大鼠肝細胞功能，實驗結果如表1。表1：原代大鼠細胞成干細胞球比例(細胞濃度5×106cells/ml)成球率％(直徑>60微米)24h48h72h實施例172±3.678±4.389.2±1.2實施例268±1.375±3.885.6±0.6實施例361±5.069±1.686.5±0.5實施例460.5±4.268±0.875.3±0.9實施例559.8±4.069±1.275.5±0.2含血清52.3±4.969.1±0.665.2±0.6本發明無血清培養基可以支持肝細胞高密度懸浮培養，密度在5×106cells/ml×107cells/ml之間時，成球率高于60％，與含血清培養基培養效果相當。綜上，本發明提供的無血清培養基化學成分明確且成本低廉，不含動物來源成分，能夠支持肝細胞高密度懸浮培養生長，明顯優于傳統含血清培養基和現有文獻報道的無血清培養基，可用于細胞移植、組織工程肝臟和生物人工肝支持系統治療，具有良好的市場應用前景。上述描述僅是對本發明部分實施例的描述，并非對本發明范圍的任何限定，本行業的普通技術人員可根據本發明對上述實施例做出改進或修改，但均屬于本發明保護范圍。當前第1頁12