本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨髓中除含有能分化發(fā)育成各種血細(xì)胞的造血干細(xì)胞之外，還含有產(chǎn)生非造血組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)，因其比較容易貼壁和形成成纖維樣的克隆，因此有的文獻(xiàn)也把msc、稱(chēng)做貼壁細(xì)胞(成纖維細(xì)胞集落形成單位(cfu-f)。由于它們來(lái)自骨髓的支持結(jié)構(gòu)，并且可以作為滋養(yǎng)層支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此也有人稱(chēng)其為骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

mscs具有多向分化潛能已經(jīng)被體內(nèi)外試驗(yàn)所驗(yàn)證。friedenstem首先證實(shí)了msg、具有分化為骨、軟骨、纖維組織的能力。1999年pittenger等從人的骼骨骨髓樣本中分離得到了mscs，在體外不同分化條件的誘導(dǎo)下，可以形成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，并且克隆以后的細(xì)胞具有類(lèi)似的分化特性，充分證明骨髓mscs是多潛能干細(xì)胞。但是，pittenger等人的實(shí)驗(yàn)尚不能證實(shí)分離到的msg、是否是定型祖細(xì)胞的混合物，骨髓中是否真的存在具有多向分化潛能的單個(gè)干細(xì)胞。halleu等將分離到的間充質(zhì)細(xì)胞稀釋后以低密度接種，結(jié)果由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)而成的克隆能在體外連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)20多代，并可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞，從而證實(shí)了骨髓中分離出來(lái)的間充質(zhì)細(xì)胞中含有具有干細(xì)胞特性即高度自我更新能力和多系分化潛能的單個(gè)細(xì)胞。anita等通過(guò)使用骨髓基質(zhì)細(xì)胞的克隆培養(yǎng)，分析185個(gè)非無(wú)限增殖的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞克隆分化為成骨、成軟骨、成脂肪細(xì)胞的能力，證實(shí)了mscs的體外分化模型:能分化成這三個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞是早期的間充質(zhì)祖細(xì)胞，其分化潛能的有序丟失使得分化的方向逐步減少。近20年來(lái)關(guān)于msg、多潛能性的報(bào)道很多，這類(lèi)體外研究試驗(yàn)均是針對(duì)不同分化方向采用了各種不同的誘導(dǎo)劑，分別使mscs向不同的終末細(xì)胞例如成骨、成軟骨、成脂肪、成肌細(xì)胞等分化。

mscs具有取材方便，在體外培養(yǎng)能保持其多向分化潛能，遺傳背景穩(wěn)定，植入體內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng)，易于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)，是組織工程中理想的種子細(xì)胞。雖然mscs的多向分化潛能已經(jīng)被廣泛的證實(shí)，但是它的體內(nèi)試驗(yàn)僅限于用小動(dòng)物mscs來(lái)修復(fù)自身的組織缺損。為了將mscs用于大動(dòng)物和與人類(lèi)接近的靈長(zhǎng)目動(dòng)物，傅文玉等將培養(yǎng)的人骨髓mscs注入裸鼠皮下，一個(gè)月后在注射局部觀察到了人mscs分化的骨、軟骨、脂肪、骨骼肌、肌鍵樣組織等多種組織類(lèi)型。tippi等建立了異基因的人胎羊模型，將人msg、植入到胎羊中，觀察到人mscs在胎羊中存活長(zhǎng)達(dá)13個(gè)月，并且部位特異性地分化為脂肪、軟骨、肌細(xì)胞等，進(jìn)一步證實(shí)了移植以后mscs仍具有多系分化潛能，還觀察到在人胎羊模型的損傷部位，人mscs分化的細(xì)胞量增加，推測(cè)可能是植入的mscs在這種損傷環(huán)境下被誘導(dǎo)擴(kuò)增和參加組織修復(fù)或者再生反應(yīng)。該研究為那些在子宮中就可以診斷出來(lái)的骨生成缺損，肌肉萎縮癥等疾病的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

mscs比較容易從病人的骨髓中分離出來(lái)，在體外多倍擴(kuò)增以后，進(jìn)行多種目的性操作，然后重新輸回病人體內(nèi)，其間制備好的細(xì)胞不可避免的需要冷凍保藏備用。目前，干細(xì)胞凍存使用的凍存液有含血清和無(wú)血清的兩類(lèi)，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢(shì)。低溫保存干細(xì)胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護(hù)。常用到的細(xì)胞保護(hù)劑還有羥乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對(duì)凍存的干細(xì)胞造成不可逆的損傷。為獲得來(lái)源方便的mscs干細(xì)胞，開(kāi)展有效的mscs干細(xì)胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長(zhǎng)期低溫保存mscs干細(xì)胞的方法對(duì)于促進(jìn)mscs干細(xì)胞的研宄和應(yīng)用具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑以及相應(yīng)的制備方法及使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑，其特征在于由如下各組分組成：0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，維生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-2任一所示。所述多肽由發(fā)明人通過(guò)特異性針對(duì)mscs細(xì)胞進(jìn)行的前期的大量的基因庫(kù)篩選得到，所述多肽具有保護(hù)mscs細(xì)胞免受損傷的功能。其名稱(chēng)分別為mscs-1(sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc)、mscs-2(karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh)。

在本發(fā)明的細(xì)胞的凍存液中，甘油和海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來(lái)傷害對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是多肽，還具有保護(hù)細(xì)胞免受凍存時(shí)冰結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷，其余集中組分對(duì)于維持特異性的mscs細(xì)胞的生存是必須的。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。

本發(fā)明還提供了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存方法，包括以下步驟:

a.凍存液制備:制備所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；

b.細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的mscs細(xì)胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；

c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；

d.細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋?zhuān)?000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次。所述細(xì)胞懸浮濃度為10⁸細(xì)胞/ml-10¹⁰細(xì)胞/ml。

本發(fā)明的有益效果:

本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，復(fù)蘇細(xì)胞存活率可達(dá)98.5％以上，較使用常規(guī)細(xì)胞凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒(méi)有細(xì)胞的損耗。

本發(fā)明的mscs干細(xì)胞凍存液可以長(zhǎng)期保存mscs干細(xì)胞，細(xì)胞活性不發(fā)生變化，保證了細(xì)胞生物學(xué)活性。

本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，操作簡(jiǎn)單可行，價(jià)格適宜，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

分別加入0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，維生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。其中多肽的序列如sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc所示。

實(shí)施例2

分別加入0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，維生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。其中多肽的序列如karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh所示。

比較例i

分別量取70ml的mem細(xì)胞培養(yǎng)液、20ml的小牛血清、i0ml的二甲基亞砜，混合制得常規(guī)細(xì)胞凍存液。

比較例ii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

比較例iii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

實(shí)施例3凍存液的效果驗(yàn)證

以上實(shí)施例1-2及比較例i-iii所制備的細(xì)胞凍存液，分別按照下述方法進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞凍存過(guò)程:

培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的人白血病干細(xì)胞，其細(xì)胞密度約6*10⁹個(gè)/ml，加入ph7.0的pbs洗細(xì)胞表面一次。

將細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實(shí)施例1-3和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；

冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個(gè)月，8個(gè)月。每組3個(gè)重復(fù)。

細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋?zhuān)?000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果如下：

取8個(gè)月的凍存細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分化培養(yǎng)，其中所述的mscs細(xì)胞能夠正常進(jìn)行分化，分化效率達(dá)到95.3％，而比較例i-iii取出的細(xì)胞其分化率只能達(dá)到58.4％,60.2％，80.5％，這充分的說(shuō)明細(xì)胞活性收到很大的影響。

實(shí)施例4特異性檢測(cè)

將實(shí)施例1的培養(yǎng)基，分別針對(duì)其他幾種干細(xì)胞：造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞進(jìn)行采用實(shí)施例3的培養(yǎng)方式進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，通過(guò)8個(gè)月的凍存試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，8個(gè)月之后的這幾種細(xì)胞存活率均處于80％-90％的存活率之間，說(shuō)明，本發(fā)明的冷凍劑可以特異性的培養(yǎng)mscs。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

〈110〉陳印平

〈120〉一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉mscs-1

sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc

〈211〉26

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉mscs-2

karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh