具有運鐵蛋白肽的外切體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及在其表面上包括運鐵蛋白靶向部分的外切體，產生它們的方法，和此類外切體用于體內遞送遺傳物質和/或生物治療性蛋白或肽或化療試劑的用途，尤其涉及此類外切體在基因療法或基因沉默、或遞送其他治療劑的方法中的用途。
【專利說明】具有運鐵蛋白肽的外切體 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及將外切體靶向期望的細胞類型或組織。具體而言，本發明涉及外切體， 和產生它們的方法，所述外切體包括在外切體的表面上表達的靶向部分。 【背景技術】
[0002] 核酸常規上用于基因療法用于替換非功能基因[1]，并且經RNA干擾（RNAi)效應 器分子比如miRNAs[2]、 ShRNAs[3]和siRNAs[4]用于抵消致病的突變。由于快速清除[5]、 核酸酶[6]、缺乏器官特異性分布和低效的細胞攝取，裸露DNA和RNA難以在體內遞送，通常 專用的基因遞送載體用于遞送。
[0003] 病毒載體和陽離子脂質體是最前沿的遞送載體技術并且已經是相對成功的，大量 的這些遞送載體已經在臨床試驗中[7]。盡管這些成功，仍有明顯的局限限制許多應用，最 顯著的局限是對于大部分病毒載體的免疫識別[8,9,10]和對于病毒比如慢病毒的誘變整 合[11];和炎癥毒性和對于脂質體的快速清除[12,13,14,15]。通過先天免疫系統的識別 導致急性炎癥反應，其可需要使用免疫抑制策略以克服現有策略潛在地將患者暴露于機會 性感染的冒險的攝取和再施用問題[16,17,18]。針對遞送媒介產生的抗體也使得在隨后的 施用中轉基因表達急劇地減少[19]。
[0004] 現有策略的固有風險和限制已經通常將它們限于治療的益處明顯超過風險的威 脅人類生命的疾病，比如重癥聯合免疫缺陷[20]，限于特定環境比如類似眼的免疫豁免部 位中的疾病[1]，或用于基因接種[21]。但是，對于慢性的和使人虛弱但不是危及生命的遺 傳疾病，比如肌強直性營養不良，需要相當更低的風險特征并且維持矯正基因治療的能力 幾十年，不是幾年，用于治療介入。對于次類疾病潛在地不可接受的風險的例子是以上討論 的免疫抑制策略，突出的是由于試驗管理員未知的對象服用的免疫抑制劑[22]引起的機 會性感染，在最近的風濕性關節炎的AAV基因治療試驗中健康患者的死亡。隨著逐漸增多 數量的疾病顯示具有遺傳成分，包括肥胖、心臟疾病和精神疾病，有很大的可能性修飾易感 基因用于預先的遺傳方案，但是僅僅如果風險進一步下降并且實現長期的維持能力。因此， 需要開發這樣的技術，其能夠避免免疫識別和炎癥，同時保留好的遞送效率，以便擴展基因 療法在致死疾病之外的用途。
[0005] 方案之一可能在于使用特異性靶向待治療的細胞類型或器官的外切體用于基因 遞送。外切體是內吞起源的小膜結合囊泡（30-100nm)，其在多泡體與質膜融合之后釋放進 入細胞外環境。已經對許多免疫細胞，包括B細胞、T細胞和樹突細胞（DC)描述了外切體 產生。衍生自B淋巴細胞和成熟DC的外切體表達MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-1 [23, 24]， 并且在實驗模型和臨床試驗中已經用于誘導特定的抗腫瘤T細胞毒素應答和抗腫瘤免疫 [24, 25]。外切體介導的基因遞送的潛能已經由遞送鼠 mRNAs和miRNAs至人肥大細胞顯示 [26]，并且神經膠質瘤衍生的外切體[27]已經表明將外源DNA質粒產生的mRNA轉移至異 源細胞。也已經公開了具有外源DNA、siRNA和其他修飾寡核苷酸的外切體[28]。
【發明內容】

[0006] 本發明人也已成功地將靶向部分引入外切體，從而外切體可被靶向所選擇的組 織。尤其，本發明人已成功地將運鐵蛋白（Tf)肽靶向部分引入外切體，從而外切體可被靶 向表達運鐵蛋白受體（TfR)的組織或細胞。本發明人已經顯示表達Tf肽靶向部分的外切 體具有與商業上可獲得的常規的轉染試劑比如lipofectamine和RNAi max相當的攝取效 率。因此，本發明涉及在表面上包括Tf肽靶向部分的外切體、包括外切體跨膜蛋白和靶向 部分的融合蛋白，并且涉及編碼此類融合蛋白的核酸構建體。Tf靶向外切體可用貨物比如 外源遺傳物質或生物治療性蛋白和/或肽、和/或化療試劑裝載并且用于貨物的遞送，尤其 用于核酸的遞送用于基因治療和基因沉默，以及生物治療性蛋白和肽和化療試劑的遞送用 于治療。
[0007] 根據本發明的一個方面，提供了包括外切體的組合物，其中外切體包括在外切體 的表面上表達的靶向部分，并且所述靶向部分是運鐵蛋白（Tf)多肽或肽。Tf多肽靶向部分 或Tf肽靶向部分可以是保留與TfR結合的能力的任何Tf多肽或Tf肽。
[0008] 在另一方面中，本發明提供包括外切體的組合物，其用于體內遞送遺傳物質、蛋白 質和/或肽的方法中，該外切體包括在外切體的表面上表達的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，其中該外切體衍生自不成熟的樹突細胞。
[0009] 在另一方面中，本發明提供產生外切體的方法，該外切體包括在外切體的表面上 表達的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分，該方法包括在用于產生外切體的細胞中表達包 括靶向部分和外切體跨膜蛋白的融合蛋白，其中隨著該細胞產生融合蛋白，表達的融合蛋 白并入外切體。
[0010] 在另一方面中，本發明提供包括外切體跨膜蛋白和異源靶向蛋白、多肽或肽的多 肽，其中靶向蛋白、多肽或肽是與在待靶向的細胞表面上存在的TfR結合的Tf多肽或Tf 肽，并且其中當多肽存在于外切體中時，該靶向Tf多肽或Tf肽存在于外切體的表面上。
[0011] 在另一實施方式中，本發明提供編碼多肽的多核苷酸構建體，其中該構建體包括 編碼5'外切體跨膜信號序列的多核苷酸，例如內質網靶向信號肽，其可操作地連接至編碼 本發明多肽的多核苷酸。
[0012] 在另一實施方式中，本發明提供將外切體靶向所選擇的組織或細胞類型的方法， 所述方法包括用根據本發明的多核苷酸構建體轉染宿主細胞，在宿主細胞中表達構建體， 和從已經表達該構建體的宿主細胞中獲得外切體。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.用外切體介導的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標記的GAPDH siRNA應用至具有電穿孔的（E)非靶向的外切體（Exo非靶向的）、Tf-靶向的外切體（Exo Tf)或RVG靶向的外切體（Exo RVG)的HEK細胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體和 siRNA (NE)作為陰性對照并且添加 siRNA和常規的轉染試劑（LIP0和RNAi max)作為陽性 對照。
[0014] 圖2.用外切體介導的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標記的GAPDH siRNA 應用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（Exo Tf) 或RVG靶向的外切體（Exo RVG)的B2M17細胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體和 siRNA(NE)作為陰性對照并且添加 siRNA和常規的轉染試劑（LIPO和RNAi max)作為陽性 對照。
[0015] 圖3.用外切體介導的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標記的GAPDH siRNA 應用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（ExoTf)或 RVG靶向的外切體（Exo RVG)的腦神經瘤細胞（Neur〇2a)的代表性圖像。添加非電穿孔的 外切體和siRNA (NE)作為陰性對照并且添加 siRNA和常規的轉染試劑（LIP0和RNAi max) 作為陽性對照。
[0016] 圖4.用外切體介導的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標記的GAPDH siRNA 應用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（Exo Tf)或 RVG靶向的外切體（Exo RVG)的小鼠骨髓樹突細胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體 和siRNA (NE)作為陰性對照并且添加 siRNA和常規的轉染試劑（LIP0和RNAi max)作為陽 性對照。 【具體實施方式】
[0017] 本發明涉及外切體，以及它們作為遞送媒介的用途。外切體是內吞起源的小膜結 合囊泡，其在多泡體與質膜融合之后被釋放進入細胞外環境。因此，本申請涉及包括此類外 切體的組合物。典型地，外切體的直徑在30和100nm之間，但是可包括多達200nm的相似 起源的膜顆粒。如本文所使用，外切體指由多泡體分泌的內體起源的納米顆粒。
[0018] 外切體由許多不同類型的細胞產生，包括免疫細胞比如B淋巴細胞、T淋巴細胞、 樹突細胞（DC)和肥大細胞。外切體也由以下產生，例如神經膠質瘤細胞、血小板、網織紅細 胞、神經元、小腸上皮細胞、腫瘤細胞、HELA細胞、人胚胎腎細胞（HEK細胞）、B2M17細胞、 Bend3細胞、原代骨髓衍生的樹突細胞、BV-2小膠質細胞和腦神經瘤（NEUR02A)細胞。根據 本申請使用的外切體可衍生自任何適合的細胞，包括以上識別的細胞。外切體也已經從生 理液體分離，比如血漿、尿、羊膜液和惡性積液。
[0019] 在本發明的優選方面中，外切體衍生自DC，優選不成熟的DC。由不成熟的DC產生 的外切體不表達MHC-II、MHC-I或⑶86。如此，此類外切體不明顯刺激幼稚T細胞并且不 能在混合的淋巴細胞反應中誘導應答。因此，由不成熟的樹突細胞產生的外切體是用于遞 送貨物，比如遺傳物質，尤其用于體內使用，例如基因療法中的理想候選物。
[0020] 因此，根據本發明的一個方面，提供衍生自樹突細胞的外切體，用于貨物--比如 遺傳物質和蛋白質和/或肽生物治療劑或化療劑--的體內靶向遞送。在優選的實施方式 中，本發明的外切體衍生自樹突細胞并且提供用于遺傳物質、蛋白質或肽生物治療劑或化 療劑的體內靶向遞送。
[0021] 如上所概述，外切體由許多不同類型的細胞產生并且也已經從生理液體分離。因 此，根據本發明，外切體可從以上討論的任何合適的細胞類型獲得，或通過從生理液體分離 獲得。典型地，本發明的方法包括從細胞培養基或組織上清液分離外切體。
[0022] 可通過任何合適的方法從培養基收集由細胞產生的外切體。典型地，外切體的 制品可通過離心、過濾或這些方法的組合從細胞培養物或組織上清液制備。例如，外切體 可通過如下制備：差速離心，即低速（<20000g)離心以使較大顆粒成團，接著通過高速 OlOOOOOg)離心以使外切體成團、用合適的過濾器（例如，0.22 μ m過濾器）的粒度過濾、 梯度超速離心（例如，蔗糖梯度）或這些方法的組合。
[0023] 根據本發明，本發明的外切體可用外源遺傳物質、蛋白質或肽或化療劑裝載。尤 其，根據本發明，可制備外切體并且然后用期望的遺傳物質、蛋白質或肽、或化療劑裝載，用 于靶向遞送。外切體也可用外源遺傳物質或生物治療性蛋白或肽裝載，通過在細胞中過表 達編碼遺傳物質或蛋白質或肽的合適的構建體，從而將物質裝載進入外切體。
[0024] 相比遞送這種分子的常規手段，Tf_靶向的外切體遞送外源遺傳物質、蛋白質或肽 的用途提供了許多優勢。例如，當化合物使用外切體遞送時，它們被保護避免降解并且更 穩定；化合物可被遞送至靶組織，比如特定類型的癌癥，比如果沒有封裝在外切體內更有效 和/或更特異；和/或該貨物可能不太可能引起免疫應答，因為它包含在外切體中并且所以 不能自由地被免疫細胞探測到，和/或結合抗體。Tf-靶向的外切體遞送外源遺傳物質、蛋 白質或肽或化療劑用途的其他潛在的優勢包括在外切體的全身性遞送之后繞過肝細胞和/ 或避免耐藥性，比如藥物轉運體比如ABC-轉運體的上調。
[0025] 用于遞送的適合的遺傳物質包括外源DNA質粒和siRNA。合適的遺傳物質也包括 修飾的寡核苷酸和其他RNA干擾效應器部分比如miRNA和shRNA。根據本發明的一個方面， 裝載進入外切體的遺傳物質不是通常與外切體相關的遺傳物質，例如，核酸優選地不是當 其由細胞產生時并入外切體的mRNA或miRNA。尤其，遺傳物質可裝載進入已經與細胞分離 的外切體制品。可選地遺傳物質可以在細胞中過表達，例如通過將合適的構建體引入細胞， 并且隨后裝載進入外切體。因此，外源遺傳物質指包括通常與外切體不相關的核酸的遺傳 物質。在尤其優選的實施方式中，核酸物質是通常不出現在外切體中的質粒DNA或其他核 酸比如siRNA和修飾的寡核苷酸。
[0026] 相似地，優選地裝載進入外切體的蛋白質或肽不是通常與外切體相關的蛋白質或 肽，例如，蛋白質或肽優選地不是當其由細胞--比如未修飾的細胞--產生時被并入外 切體的蛋白質或肽。外源蛋白質或肽指包括通常與外切體不相關的蛋白質或肽的蛋白質或 肽。此類外源蛋白質或肽可裝載進入已經與細胞分離的外切體，或通過在宿主細胞中過表 達合適的構建體，以便蛋白質或肽被裝載進入外切體。在尤其優選的實施方式中，待裝載進 入外切體的蛋白質或肽是抗體或抗體片段，更優選地是單克隆抗體或其片段。
[0027] 用于并入外切體的核酸可以是單鏈的或雙鏈的。單鏈核酸包括具有磷酸二酯、 2' 0-甲基、2'甲氧乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和/或磷酸酯骨架化學的那些。通常，引 入的雙鏈核酸包括例如質粒DNA和小干擾RNAs (siRNAs)。
[0028] 用于病況、疾病或不適的治療和/或預防的任何生物治療性蛋白和/或肽可并入 根據本發明的外切體。在優選的實施方式中，并入外切體的蛋白質或肽是抗體或抗體片段。 在更優選的實施方式中，抗體是單克隆抗體或其片段。
[0029] 外切體也可用化療劑--比如治療藥劑--裝載，用于化療劑的遞送。合適的藥 劑的例子包括細胞毒素劑，例如用于癌癥的治療。
[0030] 基于遺傳物質、蛋白質或肽對其期望遞送進入細胞的效果和進行該效果的機理選 擇待裝載進入外切體的遺傳物質、蛋白質或肽。例如，核酸可用于基因治療，例如為了在細 胞或細胞組中表達期望的基因。此類核酸通常以編碼期望基因的質粒DNA或病毒載體的形 式，并且其可操作地連接至合適的調節序列比如啟動子、增強子等，使得一旦其被遞送至待 治療的細胞，則表達質粒DNA。對基因治療易感的疾病的例子包括血友病B (因子IX)、囊性 纖維化（CTFR)和脊髓性肌萎縮（SMN-1)。
[0031] 核酸可也用于例如免疫以表達期望針對其產生免疫應答的一種或多種抗原。因 此，待裝載進入外切體的核酸可編碼期望針對其產生免疫應答的一種或多種抗原，包括但 不限于腫瘤抗原，來自病原體比如病毒、細菌或真菌病原體的抗原。
[0032] 核酸也可用于基因沉默。這種基因沉默可在治療中用于關閉異常基因表達或在 動物模型研究中用于產生單個或更多個遺傳敲除。通常，此類核酸以siRNAs的形式提供。 例如，包括siRNAs的RNAi分子可用于在肌細胞中敲低具有多個CUG重復的DMPK以治療 肌強直性營養不良。在其他實施例中，表達減少造成亨廷頓病的突變體亨廷頓基因（htt) 的shRNA的質粒可用神經元特異外切體遞送。其他靶基因包括用于治療阿爾茨海默氏疾病 的BACE-1。一些癌基因也可用siRNA或shRNAs比如ras、c-myc和VEGFR-2靶向。腦靶向 siRNA裝載的外切體可尤其用于阿爾茨海默氏疾病中BACE-1的沉默、帕金森疾病中α -突 觸核蛋白（synuclein)的沉默、亨廷頓疾病中htt的沉默和用于治療中風以降低缺血損壞 的神經元胱冬酶-3的沉默。
[0033] 可使用包括2' -Ο-Me化合物和PNA的反義修飾的寡核苷酸。例如，此類寡核苷酸 可設計為誘導外顯子跳躍，例如突變體抗肌萎縮蛋白基因可被遞送至肌細胞用于治療杜興 氏肌營養不良癥，例如抑制發夾環的反義寡核苷酸用于治療肌強直性營養不良和例如反式 剪接寡核苷酸用于治療脊髓性肌萎縮。
[〇〇34] 作為用遺傳物質裝載本發明外切體的可選項，可裝載蛋白質或肽。用于病況、疾病 或不適的治療和/或預防的任何生物治療性蛋白和/或肽可并入根據本發明的外切體。在 優選的實施方式中，并入外切體的蛋白質或肽是抗體或抗體片段。單個蛋白質或肽可并入 外切體。可選地，多于一種的蛋白質和/或肽可并入外切體。多于一種的蛋白質和/或肽 可作用在相同的或不同的靶上以帶來其治療和/或預防效果。
[0035] 待并入外切體的蛋白質和/或肽可例如用于癌癥的治療和/或預防。可使用蛋白 質或肽生物治療劑治療的癌癥的例子包括白血病、結直腸癌、頭頸癌、非霍奇金氏淋巴瘤、 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、腺癌和實體腫瘤。此類生物治療性蛋白和/或肽 典型地是抗體或其片段，尤其是單克隆抗體或其片段。
[〇〇36] 蛋白質和/或肽生物治療也可用于自身免疫性疾病的治療和/或預防。自身免疫 性疾病起因于身體對通常存在于身體中的物質、組織和器官的過度活躍的免疫應答。
[0037] 裝載進入根據本發明的外切體的生物治療性蛋白和/或肽也可用于治療和/或預 防其他病況，包括心血管疾病、血友病、膿毒、中風、包括杜興氏肌營養不良（DMD)的肌營養 不良、黃斑變性和阿爾茨海默氏疾病。
[0038] 在優選的實施方式中，裝載進入根據本發明的外切體的生物治療劑是治療性 抗體。在更優選的實施方式中，治療性抗體選自用于封閉Bace-Ι和b-淀粉樣蛋白 (b-amyloids)的活化位點的單克隆抗體；針對成膠質細胞瘤激酶的單克隆抗體和針對α4 整聯蛋白質用于治療MS的抗體，例如那他珠單抗（Natalizumab)。
[0039] 在優選的實施方式中，裝載進入根據本發明的外切體的生物治療劑是肽。在 更優選的實施方式中，肽選自用于引起對病毒和/或腫瘤抗原的免疫應答的免疫顯性 (immune-dominant)肽；神經保護肽，比如δ -阿片樣物質受體配體，例如Biphalin ;用于 神經炎癥的免疫抑制肽，例如腎上腺髓質素和結合并且抑制NfKB信號傳導的NBD肽。
[0040] 外源遺傳物質、蛋白質或肽或化療劑可通過許多不同的技術引入外切體。例如，夕卜 切體可通過電穿孔或使用轉染試劑裝載。盡管外切體的小尺寸，仍可能使用電穿孔用外源 遺傳物質裝載外切體[W02010/119256]。考慮到與細胞相比外切體的小尺寸，這是令人吃驚 的。考慮外切體的尺寸，用于細胞電穿孔的電壓的外推將提示外切體的電穿孔將需要超高 電壓。但是，令人吃驚地，使用電穿孔用質粒DNA和siRNA裝載外切體是可能的。電穿孔條 件可根據貨物的電荷和尺寸而改變。典型的電壓范圍為20V/cm至1000V/cm，比如20V/cm 至100V/cm，電容通常在25 μ F和250 μ F之間，比如25 μ F和125 μ F之間。對于用抗體裝 載本發明的外切體，范圍為150mV至250mV，具體地200mV的電壓是優選的。
[0041] 外切體也可使用轉染劑裝載。盡管外切體的小尺寸，常規的轉染試劑可用于用遺 傳物質轉染外切體。根據本發明使用的優選的轉染試劑包括陽離子脂質體。
[0042] 外切體也可通過用核酸構建體轉化或轉染宿主細胞裝載，所述核酸構建體表達感 興趣的遺傳物質或生物治療性蛋白或肽，以便隨著在細胞中產生外切體，遺傳物質、生物治 療性蛋白或肽攝入外切體。
[0043] 靶向
[0044] 根據本發明，外切體靶向期望的細胞類型或組織。通過在外切體的表面上表達靶 向部分實現該靶向，所述靶向部分結合在待靶向的細胞表面上表達的細胞表面部分。根據 本發明，靶向部分是運鐵蛋白（Tf)多肽或肽。在優選的實施方式中，靶向部分是Tf肽。典 型地，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分表達為與通常在外切體的表面上表達的跨膜蛋白 的融合蛋白。
[0045] Tf是糖蛋白，其以高親和力可逆地結合鐵。人運鐵蛋白（Tf-h)由具有698個氨 基酸殘基的單條多肽鏈組成并且分子量為約80kDa。Tf-h的多肽序列顯示在SEQ ID NO: 1 中。人Tf基因的多核苷酸序列顯示在SEQIDN0:2中。Tf-h以高親和力結合兩個Fe3+離 子。四個不同的具有不同鐵含量的同種型Tf共存在血漿中 ：（l)ap〇-運鐵蛋白（APOTf，沒 有鐵離子）；（2)單鐵運鐵蛋白（鐵在C-末端結構域）；（3)單鐵運鐵蛋白（鐵在N-末端結 構域）和（4)二鐵運鐵蛋白（鐵在兩個結合位點）。在本發明的上下文中，Tf包括任何這 四個同種型，單獨或彼此組合。
[0046] Tf受體（TfR)是二硫化物-連接的同型二聚體糖蛋白，其在許多腫瘤的細胞表面 高度表達。在本發明的優選實施方式中，存在于待被本發明的外切體靶向的細胞上的部分 是TfR，其結合在外切體的表面上表達的Tf多肽或Tf肽靶向部分。
[0047] 更詳細地，本發明的外切體可通過在它們表面上表達Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，靶向具體的細胞類型或組織。合適的肽是結合在待靶向細胞的細胞表面上出現的 細胞表面部分比如受體或它們的配體的那些。在優選的實施方式中，Tf多肽靶向部分或Tf 肽靶向部分結合待靶向細胞的細胞表面上的TfR。合適的靶向部分的例子是短肽和完整的 Tf蛋白，只要靶向部分可在外切體的表面上表達并且不干擾膜蛋白插入外切體。典型地，靶 向肽相對于跨膜外切體蛋白是異源的。肽靶向部分的長度可通常小于100個氨基酸，例如 小于50個氨基酸的長度，小于30個氨基酸的長度，至10、5或4個氨基酸的最小長度。
[0048] 在優選的實施方式中，最小Tf靶向部分的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的Tf蛋白的 氨基酸50至56,即氨基酸序列PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
[0049] 在尤其優選的實施方式中，Tf靶向多肽或肽由下述組成或包括下述：氨基酸序列 CRTIGPSVC(SEQ ID N0:3)和/或SEQ ID N0:1的Tf蛋白的氨基酸50至56,即氨基酸序列 PSDGPSV(SEQ ID N0:4)〇
[0050] 包括SEQ ID N0S:3或4的氨基酸序列的肽片段可用作本發明的靶向部分。這些片 段的長度可為10個氨基酸或更短，20個氨基酸或更短的長度，30個氨基酸或更短的長度， 50個氨基酸或更短的長度，100個氨基酸或更短的長度或更多。在優選的實施方式中，片段 的長度為10個氨基酸或更短。片段優選地是SEQ ID NO: 1的Tf蛋白片段。全長Tf蛋白可 也用作本發明外切體中的靶向部分。
[0051] TfR在不成熟的紅系細胞、胎盤組織和快速分裂的正常和惡性細胞中高度表達。因 此，比如例如Tf蛋白、多肽和肽靶向部分可用于靶向具體的組織類型，或靶向患病的組織 比如腫瘤。在本發明尤其優選的實施方式中，外切體靶向腫瘤。
[0052] 本發明的Tf靶向外切體可特別有利地使貨物能夠遞送至所有的細胞類型并且跨 物種。這是因為Tf在跨物種中是高度保守的并且TfR在許多細胞類型的表面上普遍表達。 因此，例如，本發明的小鼠外切體可被人細胞攝取并且本發明的人外切體可被小鼠細胞攝 取。如此，Tf靶向外切體可認為是通用的體外轉染試劑。另外，體內Tf靶向外切體理想地 用于靶向具有提高的TfR表達的靶向組織，比如血腦屏障（BBB)的內皮細胞，腫瘤細胞和局 部缺氧的位點（如在心臟的局部缺血或中風后的局部缺血）。
[0053] 因此，本發明的Tf靶向外切體的潛在用途包括橫跨BBB的遺傳和非遺傳貨物的靶 向；癌癥療法對腫瘤的靶向，因為相對于周圍組織，腫瘤細胞表達顯著提高水平的TfR ;和 療法對涉及局部缺血的疾病的靶向，比如其中也具有提高水平的TfR表達的缺血性心臟病 和中風。
[0054] 與非靶向的外切體相比，在根據本發明的外切體的表面上Tf靶向部分的表達可 增加由靶細胞對所述外切體和其貨物的攝取至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至 少十倍或至少二十倍。與使用常規商業上可獲得的轉染試劑比如lipofectamine或RNAi max遞送相同的貨物的攝取水平相比，在根據本發明的外切體的表面上Tf靶向部分的表達 可產生的靶細胞對外切體貨物的攝取水平相當。可選地，與使用常規商業上可獲得的轉染 試劑遞送相同的貨物的攝取水平相比，在根據本發明的外切體的表面上Tf靶向部分的表 達可增加通過靶細胞對外切體貨物的攝取至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少 十倍或至少二十倍。
[0055] 通過將其表達為與外切體跨膜蛋白的融合蛋白，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部 分在外切體的表面上表達。已知許多蛋白質與外切體相關；即隨著其形成，它們被并入外 切體。根據本發明使用的優選的蛋白質是跨膜蛋白的那些。例子包括但不限于Lamp-1、 Lamp-2、CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、 ICAM-1、整合蛋白 a4、LiCAM、LFA-l、Mac-la 和 @、Vti-lA 和B、CD3e 和 4、CD9、CD18、 CD37、CD53、CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I 或MHC-II組分、TCRi3和四次跨膜蛋白。在本發明尤其優選的實施方式中，跨膜蛋白選自 Lamp-1、Lamp-2、0)13、0)86、Floti 11 in、Syntaxin-3。在尤其優選的實施方式中，跨膜蛋白 是Lamp-2。Lamp-2的序列在SEQ ID N0:5中示出。
[0056] 以下部分涉及本發明的所有多肽的一般特征，并且尤其涉及包括在本發明的多肽 內的氨基酸序列的變體、改變、修飾或衍生。應當理解，本文所述的多肽的此類變體、改變、 修飾或衍生遵守這樣的要求，使多肽保留如可在本公開的隨后部分詳細說明的任何進一步 要求的活性或特征。
[0057] 本發明多肽的變體可通過具體水平的氨基酸同一性限定，其在本公開隨后部分詳 細描述。氨基酸同一性可使用任何適合的算法計算。例如PILEUP和BLAST算法可用于 計算同源性或排列（line up)序列（比如鑒定等同或相應的序列（通常根據它們的缺省 設置），例如如在 Altschul S.F. (1993) J Mol Evol36:290-300 ;Altschul，S，F 等（1990) J Mol Biol215:403-10中描述。用于進行BLAST分析的軟件是通過國立生物技術信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公眾可獲得的。該算法涉及首先通過鑒定查詢序列中 的短字長W鑒定高打分序列對（HSPs)，當與數據庫序列中相同的長度的字比對時，所述長 度W的短字匹配或滿足一些正值閾值打分T。T稱為鄰近字打分閾值（Altschul等，見上）。 這些初始鄰近詞命中用作開始搜索的種子，以發現包含它們的HSP。詞命中沿著每條序列 的兩個方向延伸，只要積累的比對打分可以增加。在下述情況下，停止在每個方向上詞擊 中的延伸：積累比對打分從其最大達到的值減少了 X值；由于一個或多個負打分殘基比對 的積累，積累打分變成零或更小；或到達任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比 對的靈敏度和速度。BLAST程序使用11的字長（W)、BL0SUM62打分矩陣（見Henikoff和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89 :10915-10919)、50 的比對（B)、10 的期望（E)、 Μ = 5、N = 4,和比較兩條鏈作為缺省。
[0058] BLAST算法進行兩條序列之間的相似度的統計分析；見例如，Karl in和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787。BLAST 算法提供的相似度的一種 測量是最小和概率（P (N))，其提供兩個核苷酸序列或者氨基酸序列之間偶然發生匹配的概 率的指示。例如，如果比較第一序列與第二序列，最小和概率小于約1，更優選小于約0.01， 以及最優選小于約〇. 001，那么認為序列與另一序列相似。可選地，UWGCG包提供BESTFIT 程序，其可用于計算同源性（例如使用其缺省設置）（Devereux等（1984)Necleic Acids Researchl2,387-395)。
[0059] 應當理解多肽的變體也包括替代變體。替代變體優選地涉及一個或多個氨基酸用 相同數量的氨基酸的替代并且產生保守氨基酸替代。例如，氨基酸可用具有類似性質的可 選氨基酸替代，例如，另一堿性氨基酸，另一酸性氨基酸，另一中性氨基酸，另一帶電的氨基 酸，另一親水性氨基酸，另一疏水性氨基酸，另一極性氨基酸，另一芳族氨基酸或另一脂肪 族氨基酸。20種主要氨基酸的可用于選擇合適替代的一些性質如下：
【權利要求】
1. 包括外切體的組合物，其中所述外切體包括在所述外切體的表面上表達的靶向部 分，并且所述靶向部分是運鐵蛋白（Tf)多肽或肽。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述Tf多肽包括與SEQ ID NO: 1具有至少80% 序列同一性的多肽序列或所述Tf肽來自所述多肽。
3. 根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述Tf肽包括來自SEQ ID NO: 1的所述多 肽序列的至少10個連續氨基酸殘基。
4. 根據前述權利要求任一項所述的組合物，其中所述肽選自：CRTIGPSVC(SEQIDN0:3) 或PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
5. 根據前述權利要求任一項所述的組合物，其中所述靶向部分包括與存在于待靶向的 細胞上的部分結合的肽。
6. 根據權利要求5所述的組合物，其中所述存在于待靶向的細胞上的部分是運鐵蛋白 受體（TfR)。
7. 根據權利要求5或6所述的組合物，其中所述外切體包括外切體跨膜蛋白，其已經被 修飾以并入所述肽靶向部分。
8. 根據權利要求7所述的組合物，其中所述外切體跨膜蛋白選自Lamp-1、Lamp-2、 CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin_3〇
9. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述外切體跨膜蛋白是Lamp-2b。
10. 根據權利要求9所述的組合物，其中所述靶向部分存在于Lamp-2b的N-末端處或 其附近并且用接頭序列與Lamp-2b分開。
11. 根據前述權利要求任一項所述的組合物，其中所述外切體衍生自樹突細胞。
12. 根據前述權利要求任一項所述的組合物，其中所述外切體用外源遺傳物質、蛋白質 和/或肽或化療劑裝載。
13. 根據權利要求12所述的組合物，其中所述外源遺傳物質是編碼治療性蛋白或免疫 原的DNA質粒。
14. 根據權利要求12所述的組合物，其中所述外源遺傳物質是siRNA。
15. 根據權利要求13所述的組合物，其中所述質粒編碼用于基因治療方法中的治療性 蛋白。
16. 根據權利要求13所述的組合物，其中所述質粒編碼免疫原，其用于對所述免疫原 產生免疫應答的方法中。
17. 根據權利要求12至16的任一項所述的組合物，其中所述外切體衍生自不成熟的樹 突細胞，其用于體內遞送所述遺傳物質、蛋白質和/或肽或化療劑的方法中。
18. 產生外切體的方法，所述外切體包括在所述外切體的表面上表達的Tf多肽靶向部 分或Tf肽靶向部分，所述方法包括在用于產生外切體的細胞中表達包括所述靶向部分和 外切體跨膜蛋白的融合蛋白，其中隨著所述細胞產生所述融合蛋白，表達的所述融合蛋白 并入所述外切體。
19. 根據權利要求18所述的方法，其中編碼所述融合蛋白的多核苷酸構建體轉染進入 所述細胞，所述多核苷酸構建體進一步包括啟動子和信號肽序列。
20. 根據權利要求18或19所述的方法，其中所述細胞是樹突細胞。
21. 包括外切體跨膜蛋白和異源靶向Tf多肽或Tf肽的多肽，其中所述靶向Tf多肽或 Tf肽與待靶向的細胞表面上存在的Tf受體（TfR)結合，并且其中當所述多肽存在于外切體 中時，所述靶向Tf多肽或Tf肽存在于所述外切體的表面上。
22. 編碼如權利要求22所限定的多肽的多核苷酸構建體，其中所述構建體包括編碼5' 外切體跨膜信號序列的多核苷酸，其可操作地連接至編碼本發明所述多肽的多核苷酸。
23. 根據權利要求22所述的多核苷酸構建體，其中所述外切體跨膜信號序列是內質網 革巴向信號肽。
24. 將外切體靶向所選擇的組織或細胞類型的方法，所述方法包括用如權利要求22或 23所限定的多核苷酸構建體轉染宿主細胞，在所述宿主細胞中表達所述構建體，和從其中 已經表達所述構建體的所述宿主細胞中獲得外切體。
25. 在非人動物模型中基因沉默的方法，所述方法包括向所述動物施用根據權利要求 14所述的外切體，其中所述siRNA引向待沉默的所述基因。
【文檔編號】C12N15/11GK104066453SQ201280060555
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年12月7日 優先權日:2011年12月7日
【發明者】M·伍德斯, S·拉卡爾-利特雷頓, S·伊蘭德魯斯 申請人:Isis創新公司