專利名稱：環介導等溫擴增技術檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種改進的環介導等溫擴增方法及其在檢測西伯利亞立克次體中的應用。
背景技術：
西伯利亞立克次體(Rickettsia sibirica)又名北亞蝶傳立克次體，通過硬蝶傳播引起北亞蝶傳立克次體斑疫熱(North Asian tick-borne rickettsiosis)或叫北亞蝶傳斑疫傷寒(North Asian tick typhus),呈多形態在宿主細胞的胞核內成片積集。經蝶盯咬人體時，把病原體注入人體先在局部淋巴結繁殖，以后釋放入血液形成立克次體血癥，造成血內內皮細胞炎癥，引起各個臟器的功能異常。臨床特點有發熱、初瘡，局部淋巴結腫大 及皮疹等。立克次體在自然界動物宿主與媒介之間維持持久循環。

發明內容
針對現有技術存在必須經電泳凝膠成像才可以觀察結果，或濁度儀顯示的結果信噪比低的問題，本發明的目的在于提供一種具有操作簡單、反應快速、耗時短等優點的環介導等溫擴增技術檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法。為實現上述目的，本發明涉及環介導等溫擴增技術檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，包括以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區域，引物設計包括兩個外引物和兩個內引物的設計，內引物FIP(上端內引物)包含Flc序列和F2(F2c區域的互補序列)，即5' -Flc-F2;內引物BIP(下端內引物)包含Blc(Bl區域的互補序列)和B2序列，即5' -B1C-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結合靶序列上的6個特異區域。選取的保守序列如下5' -GTATTAGCACGGGTATTGCCTCACTTTGGGGACCTGCTCACGGCGGGGCTAATGAAGCGGTAATAAATATGCTTAAAGAAATCGGTAGTTCTGAGTATATTCCTAAATATATAGCTA AA GCTA AGG ATA A A A ATF3 G ATCCATT1AGATTAATGGGTTTTGGTCA TCGTGTATATAAAAACT - F2ATGACCC GCGTG CC GCAGTACTTAAAGAAAC gtgcaaagaagtaFlcTTAAA GGAACTCGGGCAGCTAGACA令 CAATCCGCTCTTACAAATABlc
_Q CAATAGAACTTGA AGCTATCGCTCTTAAAGAl GAATAr TTTTATTGB2AGAGAAAATTAT Al CCAAArGTTGATTTTWTCCG' GTATTATCTATB3AAAGCTATGGGTATACCGTCGCAAATGTTCACTGTACTTTTTGCAATAGCAAGAACCGTAGGCTGGAT-3'設計外引物F3、B3和內引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應的互補序列第一組
權利要求
1.環介導等溫擴增技術檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，其特征在于，該方法包括 以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區域，設計外引物F3、B3和內引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應的互補序列
2.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內引物=比例范圍為I :4 I 12o
3.如權利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內引物=I:8。
4.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增溫度為580C 65O。
5.如權利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增溫度為60°C。
6.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增時間為15分鐘 60分鐘。
7.如權利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增時間為60分鐘。
8.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述非診斷性方法包括步驟 ①提取樣品DNA:使用基因組DNA提取試劑盒進彳丁 DNA的提取；②利用所述外引物F3、B3和內引物FIP、BIP、樣品DNA、酶、緩沖液配制25μ L反應體系; ③環介導等溫擴增程序； ④電泳檢測分析結果或使用熒光定量PCR儀、GenieII直接分析結果。
9.如權利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述25μ L反應體系組分如下
10.如權利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述等溫擴增采用恒溫水浴、PCR、Real-time PCR、LC320濁度儀、Geniell，使用儀器GenieII進行擴增時，試劑中加入SYBR Green I染料再進行擴增；使用所述熒光定量PCR儀進行擴增時，試劑中加入SYBRGreen I染料，進行擴增時選用SYBR通道進行熒光信號收集；試劑中加入鈣黃綠素進行擴增時選用FAM通道進行熒光信號收集。
全文摘要
本發明公開了一種環介導等溫擴增技術檢測西伯利亞立克次體的非診斷性方法，以西伯利亞立克次體GltA基因序列作為靶序列，比對后選取保守區域，設計一套引物進行擴增，并優化各反應條件。LAMP作為一種分子生物學檢測非診斷性方法，可使用濁度儀、熒光定量PCR儀或GenieII儀器檢測熒光信號判斷結果，可不需要凝膠成像判斷結果，具有快速簡便、反應時間短、特異靈敏等獨特優勢。
文檔編號C12R1/01GK102936622SQ201210367029
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者王靜, 楊宇, 楊永莉, 劉麗娟, 趙婷婷, 王旺, 王莎莎 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院