多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒。本發明的多肽由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列構成。本發明的多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒在瘧疾的診斷中是有用的。
【專利說明】多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測器件及檢測試劑盒，屬于生物【技術領域】。【背景技術】
[0002]瘧疾是一種急性傳染病，是目前世界上對人類危害最為嚴重的蚊媒寄生原蟲病，病原體是瘧原蟲，癥狀為周期性發冷發熱。由于瘧原蟲的生活周期復雜，抗原具有階段特異性等特點，瘧疾的防治成為世界性的難題之一。其中，惡性瘧疾每年感染3 - 5億人，奪取數百萬人的生命。2011年11月，世界衛生組織最新統計有2.16億瘧疾病例發生，死亡率高達655，000人。瘧原蟲主要分布在地球熱帶、亞熱帶各國，即非洲、東南亞、南美等地區，約有20億人口仍生活在疫區，每年死于瘧疾的兒童約100萬。我國在華南、華中的某些地區，特別是云南和海南省為高發區。因此，瘧疾也嚴重阻礙著發展中國家的經濟發展。
[0003]由于瘧疾治療藥物的特殊性，精確快速的診斷不僅能及時發現并治療瘧疾患者，大大降低病死率，也能通過早期排除瘧疾，及時挽救感染了其它傳染性疾病患者的生命。以此同時，精確快速的早期診斷也是對瘧疾實時流行病監測和控制的必要手段。目前，診斷瘧疾的經典方法仍為血涂片顯微鏡檢法，該方法對檢驗者的技能和檢驗要求很高，遠遠無法滿足非洲和南美洲等發展中國家中絕大多數生活在偏遠地區患者的需要。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種對瘧疾的診斷有用的多肽、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)中的用途、該多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0005]即，本發明包含下述技術方案:
[0006]1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構成的多肽。
[0007]2.一種檢測器件，其包括:
[0008]固體載體，以及
[0009]連接于該固體載體上的項I所述的多肽。
[0010]3.根據項2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0011]4.一種檢測試劑盒，其包括項I所述的多肽、或者項2或3所述的檢測器件。
[0012]5.抗項I所述的多肽的抗體。
[0013]6.項I所述的多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病的試劑盒或檢測器件中的用途。
[0014]7.項6所述的用途，其中，所述疾病是瘧疾。
[0015]8.項6或7所述的用途，其中，所述瘧原蟲是惡性瘧。
[0016]9.編碼項I所述的多肽的核酸。 [0017]10.包含項9所述的核酸的表達載體。[0018]11.導入了項10所述的表達載體的宿主細胞。
[0019]將本發明的多肽應用于瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1將多肽通過化學共價固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0021]圖2對化學合成的本發明的多肽進行確認的HPLC表征圖譜。
[0022]圖3對化學合成的本發明的多肽進行確認的MS表征圖譜。
[0023]圖4對SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)的制作過程進行說明的示意圖。
[0024]圖5對多肽微陣列化學固定過程進行說明的圖。
[0025]圖6說明多肽微陣列點樣模式的示意圖。
[0026]圖7是顯示對 健康正常人或非瘧疾病人血清進行檢測的結果的照片。
[0027]圖8是顯示對瘧疾病人血清進行檢測的結果的照片。
【具體實施方式】
[0028]本發明的多肽
[0029]本發明的多肽是30肽。本發明的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構成，即:AEKPHIPTSNCSANDIVKYEHTLKTQITL。如實施例所示，其對瘧疾病人的血清呈陽性反應，而對健康正常人或非瘧疾病人血清呈陰性反應。因此，該30肽作為瘧原蟲(例如惡性瘧)引起的疾病(例如瘧疾)的診斷工具是有用的。
[0030]本發明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用⑴化學合成方法、或(2)酶反應合成方法等公知方法來獲得，其中化學合成更為簡便。在化學合成本發明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進行。作為化學合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本【技術領域】公知的。
[0031]此外，在通過酶反應生產本發明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子W02004/011653號所述的方法。即，可以這樣來生產:將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態的氨基酸(例如羧基保護的氨基酸)在肽合成酶的存在下進行反應，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出:具有生成肽的能力的微生物的培養物、由該培養物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0032]而且，除了上述的酶方法、化學合成方法以外，有些情況下，本發明的多肽還可能是天然存在(但未被分離出來)的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來。
[0033]本發明的核酸、表達載體、宿主細胞
[0034]本發明還涉及編碼該多肽的核酸(本發明的核酸)、包含該核酸的表達載體(本發明的表達載體)、導入了該表達載體的宿主細胞(本發明的宿主細胞)，它們優選可用于生產本發明的多肽。本發明的核酸、表達載體、宿主細胞可以采用本領域技術人員公知的方法來制備。[0035]本發明的檢測器件
[0036]本發明還涉及一種檢測器件(本發明的檢測器件)，其包括固體載體、以及連接于該固體載體上的本發明的多肽。
[0037]在本發明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應混合物中分離的材料)的載體即可。
[0038]構成固體載體的材料包括但不限于:硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組
人坐I=I 寸 O
[0039]固體載體的形狀包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本【技術領域】公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0040]在本發明中，磁珠可以具有約25ηπ-約Imm范圍的球體直徑。在優選的實施方式中，磁珠具有約50ηπ-約IOym范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0041]在本發明中，由Sepharose等高交聯球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μ π-約165 μ m范圍的直徑。優選地，高交聯球形瓊脂糖珠具有約24 μ π-約44 μ m范圍的直徑。高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0042]具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0043]二氧化硅(SiO2)-處理或二氧化硅(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA購買的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。
[0044]具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences, Warrington, PA銷售的珠子(名稱:Biomag(注冊商標)羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc.,Fishers, IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子。或者，可以使用Dynal Biotech銷售的M-270等。
[0045]在本發明的一個優選實施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠。蘇州傯聚生物材料有限公司開發的一種硅橡膠材質的微陣列固體支撐材料(iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學研究常用的PDMS為基礎，在其中加入特定的引發劑成份(使該材料可通過表面引發聚合反應(SIP)實現表面功能化修飾)，再經過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol)methacrylate), pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性硅膠具有優秀的抗蛋白質非特異性吸附(Nonspecific protein adsorption, NPA)能力，可以將復雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質吸附控制到接近“絕對O”水平(接近或低于儀器的檢測極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強的信號擴增手段來提高蛋白質微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質賦予了該材料較強的機械性能和良好的可操作性。蘇州傯聚公司已經成功地將SJ改性硅膠應用于11個腫瘤標志物組成的多指標聯檢微陣列ELISA試劑盒，實現了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料是一種優秀的蛋白質微陣列固體支撐材料。同時，這種材料還具有表面性質可調的特性，可以通過控制修飾反應時間在一定范圍內調整其表面形貌。
[0046] 本發明的多肽與固體載體的連接可以采用本領域技術人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進行。例如，對于蛋白質/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-羥基玻拍酸亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反應將改性娃膠表面高分子鏈上的羧基(-C00H)基團改為活化基團，該活化基團可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應從而實現將蛋白/多肽固定于固體載體表面(參見圖1)。
[0047]對于點樣時使用的點樣液中本發明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領域技術人員可以依常規選擇，優選為I μ g^lOOO μ g/mL,更優選10 μ g^500 μ g/mL。此外，對于本發明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領域技術人員可以依常規選擇，優選為1-100 點 /10mm2，更優選 5~50 點 /IOmm20
[0048]本發明的檢測器件可以用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)、或者制備用于檢測痕原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的試劑盒。
[0049]本發明的檢測試劑盒
[0050]本發明還涉及一種檢測試劑盒(本發明的檢測試劑盒)，其包括本發明的多肽或檢測器件。該檢測試劑盒優選用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)。
[0051]本發明的檢測器件或本發明的多肽是本發明的檢測試劑盒的要件。本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0052]1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液:血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產品編號070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產品編號bwj010103)等。該血清稀釋液用來稀釋血清，試劑盒檢測的血清要稀釋適當倍數，例如2~200倍，優選10-100倍。
[0053]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0054]2.濃縮洗液:固體載體表面孵育血清及酶標二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結合的抗體和酶標二抗。濃縮洗液例如是1%的吐溫20水溶液，使用時需稀釋2~40倍、優選5~20倍。
[0055]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0056]3.酶標二抗溶液:瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)病人血清中的瘧原蟲自身抗體可與固體載體(例如SJ改性硅膠)上的本發明的多肽結合，二抗可與抗體結合，而二抗上的標記物可與發光底物反應，從而發出可檢測的光。酶標二抗可以是例如辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG。作為酶標二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術有限公司生產的辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(H+L)，產品編號ZB-2304。對酶標二抗在酶標二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例如lng~1000ng/mL。
[0057]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0058]4.發光液組分溶液:發光液可與二抗上標記的辣根過氧化物酶反應，使得反應發出儀器可檢測到的化學光。發光液由兩種溶液混合而成，分別是A液-過氧化氫溶液，及B液-發光氨溶液。發光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過才會發光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水:[0059]2 H2 O2 — 02+2H20
[0060]魯米諾與氫氧化物反應時生成了一個雙負離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產物為一個有機過氧化物。該過氧化物很不穩定，立即分解出氮氣，生成激發態的3-氨基鄰苯二甲酸。激發態至基態轉化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍光部分。發光液組分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal?_ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate,貨號 37074。
[0061]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0062]5.一個或兩個以上的反應腔體(例如中國專利授權公告CN202054829U)。
[0063]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0064]6.其他用于檢測瘧原蟲引起的疾病(例如瘧疾)的檢測分子(例如多肽、
[0065]蛋白質、核酸等)。
[0066]本發明的檢測試劑盒還可以包括:
[0067]7.使用說明書。
[0068]實施例
[0069]以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明，但并不是對本發明技術范圍的限定。通過本說明書的記載，本領域技術人員可以容易的對本發明進行修飾/改變，這些包含在本發明的技術范圍內。
[0070]1.30肽的制備與確認
[0071]實施例中使用的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成，其由吉爾生化(上海)有限公司合成，該多肽的表征圖譜見圖2和圖3，可以確認合成了所述多肽。
[0072]2.檢測器件的制備
[0073]檢測芯片是以SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過點樣固定多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發聚合反應的引發劑，并通過熱交聯(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結構中，得到一種新的材料即SJ改性硅膠。其制作過程如圖4所示。
[0074]其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個組分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgardl84)購買自美國道康寧(DowCorning)公司，包含液態組分A(成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物)和交聯劑B(成分為帶有乙烯基和S1-H基團的二甲基硅氧烷前體)兩種成分。C為末端帶乙烯基的引發劑，購于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體(01igO(ethyleneglycol)methacrylate,以下簡稱0EGMA,分子量Mw=526)購買于Aldrich。將聚二甲基娃氧烷前體A和交聯劑B與帶乙烯基末端的引發劑C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通過固化反應制成透明的彈性硅橡膠，然后通過SIP技術進行表面修飾即可得到SJ改性硅膠。實驗表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、通過共價鍵固定的引發劑，其可以通過表面引發聚合反應(SIP)實現表面高分子修飾。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進行反應獲得聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修飾的表面，實現較強的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0075]制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0076] 采用晶芯1R PersonalArrayerTM 16個人點樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列，過程為:
[0077]I)預處理
[0078]將SJ改性硅膠薄片(15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮氣吹干，馬上用于點樣。
[0079]2)點樣
[0080]將點樣液稀釋好并轉移到384孔板相應的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點樣儀基臺上，同時將預處理的改性硅膠薄片置于點樣儀的基臺上，馬上進行點樣。點樣環境條件為室溫(25°C)，濕度設定為50%。制成的多肽微陣列上每個點的點樣量約為0.6nL，樣點半徑為200 μ m。
[0081]3)化學固定
[0082]剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26°C，60%濕度)中固定至少6h。化學固定過程如圖5所示。
[0083]首先通過點樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開始蒸發，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過化學結合，改性硅膠表面的ploy(OEGM A)高分子的末端-COOH與多肽分子的-NH2形成穩定共價鍵，進而將有化學活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。
[0084]5)裝配
[0085]固定6h的多肽微陣列必須在兩天內裝配好。首先通過背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專門的反應柱上，蓋上反應腔體。一個反應器由兩個反應柱和一個反應腔體組成。
[0086]6)保存
[0087]裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0088]3.用檢測器件進行檢測
[0089]檢驗步驟
[0090]1、開始檢測前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進行稀釋，稀釋完成后直接使用。使用移液槍將2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完全浸潤。
[0091]2、將待測血清樣本用樣本稀釋液按照1:40稀釋混勻。
[0092]3、棄去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全濕潤的狀態下，每個血清樣本吸取200 μ L稀釋后的血清加入到芯片反應器內。
[0093]4、將芯片反應器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0094]5、棄去芯片反應器內的血清樣本，用15mL洗液清洗反應腔體和芯片表面3次。
[0095]6、清洗完成后，每個芯片反應器分別加入200 μ L酶標抗體溶液，將芯片反應器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0096]7、棄去芯片反應器內的酶標抗體溶液，用15mL洗液清洗反應腔體和芯片表面3次。
[0097]8、清洗完成后，取下反應腔體，每個芯片表面分別加入15 μ L發光底物液，使發光液能均勻的鋪于芯片表面。
[0098]9、將加入了發光液的芯片置于凝膠成像儀中化學發光成像，并判讀結果。[0099]惡性瘧引起的瘧疾病人的血清及其他疾病病人血清樣本由合作醫院提供。血清由相關人員用冰塊/干冰等包裹運送或快遞至實驗室。
[0100]陰性對照有PBS緩沖液(即在第3步中不用待測血清孵育，而用PBS溶液孵育，其余步驟相同)的對照，血清稀釋液的對照，及陰性病人(指健康人及非瘧疾病人)血清的對照。
[0101]多肽微陣列的點樣模式如圖6所示。其中，三角形的17個點的樣本為人IgG，作為實驗的定位點；正方形的3個點的樣本為PB點樣液，作為實驗的空白對照；星形點的樣本多肽即為本發明的多肽SEQ ID NO:1，它是瘧疾自身抗原蛋白多肽，會對瘧疾患者血清產生響應；圓形點的的樣本是其他的瘧疾自身抗原蛋白多肽，作為實驗的檢測指標(這些多肽有響應說明檢測血清中有瘧疾自身抗體)。
[0102]實驗結果如圖71所示。其中，圖7顯示了陰性對照的檢測結果，只有三角形所示的點的樣本有響應。圖8顯示了瘧疾病人血清的檢測結果，三角形、星形點和圓形的樣本有響應。需要說明的 是，儀器測得信號值由低到高，相應的信號點顏色由黑-白漸變。
【權利要求】
1.由SEQID NO:1所示的氨基酸序列構成的多肽。
2.一種檢測器件，其包括: 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權利要求1所述的多肽。
3.根據權利要求2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
4.一種檢測試劑盒，其包括權利要求1所述的多肽、或者權利要求2或3所述的檢測器件。
5.抗權利要求1所述的多肽的抗體。
6.權利要求1所述的多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病的試劑盒或檢測器件中的用途。
7.權利要求6所述的用途，其中，所述疾病是瘧疾。
8.權利要求6或7所述的用途，其中，所述瘧原蟲是惡性瘧。
9.編碼權利要求1所述的多肽的核酸、包含所述核酸的表達載體、導入了所述表達載體的宿主細胞。
【文檔編號】C12N15/63GK103965311SQ201310029588
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優先權日:2013年1月25日
【發明者】馬雄明 申請人:蘇州偲聚生物材料有限公司