本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑及應(yīng)用，本發(fā)明還涉及針對(duì)禽流感病毒h7亞型的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：禽流感(avianinfluenza)是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，它是由禽流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，被國(guó)際獸疫局定為甲類傳染病。通常禽流感只在禽類之間感染和傳播，但有時(shí)也能感染人類，自1997年香港首次發(fā)現(xiàn)人感染禽流感以來(lái)，全球多地均報(bào)告了人禽流感病例，病死率約60％。雖然禽流感被發(fā)現(xiàn)已逾百年，但至今人類并未掌握特異性的預(yù)防和治療方法，僅能以消毒、隔離、大量宰殺禽畜的方法防止其蔓延。因此，禽流感目前已成為一個(gè)重大的公共安全問(wèn)題，在給禽類和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅的同時(shí)，也給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽流感病毒(aiv)屬于正粘病毒科的甲型流感病毒，多為球形，直徑80～120nm，有囊膜，病毒表面有10～12nm的密集釘狀物或纖突覆蓋，病毒囊膜內(nèi)有螺旋形核衣殼。禽流感病毒基因組由8個(gè)負(fù)鏈的單鏈rna片段組成，共編碼10個(gè)病毒蛋白。依據(jù)其套膜上的血凝素(h)/和神經(jīng)氨酸酶(n)蛋白抗原性的不同，可分為16個(gè)h亞型(h1～h16)和9個(gè)n亞型(n1～n9)。在禽類中高致病性禽流感病毒為h5、h7亞型，典型的雞禽流感病毒為h7n7型，人感染禽流感病毒主要為h5n1、h9n2、h7n7型。h7亞型是1955年被發(fā)現(xiàn)并確定的禽流感病毒亞型，作為一種高致病性禽流感病毒，近年來(lái)，h7亞型病毒的暴發(fā)已導(dǎo)致全球超過(guò)七千萬(wàn)家禽的死亡，疫情波及歐洲、亞洲、北美洲、南美洲和大洋洲，由于該亞型病毒多為暴發(fā)型且破壞力巨大，因此引發(fā)了全球的廣泛關(guān)注。雖然目前針對(duì)h7亞型的基礎(chǔ)研究已取得了一定的進(jìn)展，例如已經(jīng)測(cè)定獲得了其ha基因的全部序列以及血凝素基因的部分序列，但我們的研究還有很大的局限，對(duì)病毒進(jìn)化、致病機(jī)制、流行規(guī)律等仍不甚了解，因此，只有進(jìn)一步加強(qiáng)在人群和動(dòng)物中對(duì)該亞型禽流感病毒的監(jiān)測(cè)，同時(shí)致力于基礎(chǔ)研究和相關(guān)疫苗及藥物的研發(fā)，才能使我們從容地應(yīng)對(duì)未來(lái)可能出現(xiàn)的禽流感疫情。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，研究開(kāi)發(fā)針對(duì)禽流感病毒h7亞型的檢測(cè)試劑，并建立操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性好、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法和檢測(cè)系統(tǒng)是很有必要的，將其推廣應(yīng)用于禽流感的早期篩查會(huì)對(duì)疫情的預(yù)防和控制產(chǎn)生積極的影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明人研究開(kāi)發(fā)了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑，并在該檢測(cè)試劑的基礎(chǔ)上建立了禽流感病毒h7亞型的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、敏感性好、特異性強(qiáng)、方便易攜帶且檢測(cè)成本較低。利用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)可在實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院、畜牧場(chǎng)、飼養(yǎng)場(chǎng)、活禽市場(chǎng)等各種場(chǎng)所即時(shí)的對(duì)禽流感病毒h7亞型進(jìn)行檢測(cè)，并能夠準(zhǔn)確、快速的獲得檢測(cè)結(jié)果。第一方面，本發(fā)明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑中包含檢測(cè)禽流感病毒h7亞型的特異性引物和探針，其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)fam標(biāo)記，3'端連接有非熒光淬滅基團(tuán)和mgb修飾基團(tuán)。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及上述檢測(cè)試劑在制備禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。尤其是，本發(fā)明還涉及上述檢測(cè)試劑在制備禽流感病毒h7n7或h7n9亞型檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還涉及上述檢測(cè)試劑在制備h7亞型禽流感診斷或治療藥物中的應(yīng)用。第二方面，本發(fā)明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒中包含標(biāo)準(zhǔn)品和熒光定量pcr反應(yīng)試劑；所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針；其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)fam標(biāo)記，3'端連接有非熒光淬滅基團(tuán)和mgb修飾基團(tuán)。進(jìn)一步地，上述檢測(cè)試劑盒中還包含陽(yáng)性對(duì)照品和/或陰性對(duì)照品。優(yōu)選地，上述檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒。優(yōu)選地，上述檢測(cè)試劑盒中的熒光定量pcr反應(yīng)試劑為冷凍干燥粉，該檢測(cè)試劑盒中還包含ddh2o。利用冷凍干燥技術(shù)將熒光定量pcr反應(yīng)試劑制成冷凍干燥粉，可有效延長(zhǎng)其保質(zhì)期，所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑冷凍干燥粉在4℃條件下的保質(zhì)期可達(dá)2年，且短途運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)需冷鏈。第三方面，本發(fā)明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)系統(tǒng)，所述檢測(cè)系統(tǒng)中包含核酸萃取試劑盒、檢測(cè)試劑盒、pockitmicro熒光pcr核酸分析儀、微型離心機(jī)和移動(dòng)電源；所述檢測(cè)試劑盒中包含標(biāo)準(zhǔn)品和熒光定量pcr反應(yīng)試劑；所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針；其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)fam標(biāo)記，3'端連接有非熒光淬滅基團(tuán)和mgb修飾基團(tuán)。優(yōu)選地，上述檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)試劑盒中包含的標(biāo)準(zhǔn)品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒；所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑為冷凍干燥粉，所述檢測(cè)試劑盒中還包含ddh2o。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)系統(tǒng)由于具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、方便易攜、節(jié)省試劑、無(wú)需電泳、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可將其推廣應(yīng)用于禽流感的早期篩查和診斷，必定會(huì)對(duì)禽流感疫情的預(yù)防和控制產(chǎn)生積極的影響。具體實(shí)施方式以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.sambrook等著，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照實(shí)驗(yàn)器材制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑盒1本檢測(cè)試劑盒中包含標(biāo)準(zhǔn)品和熒光定量pcr反應(yīng)試劑。其中，標(biāo)準(zhǔn)品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒。熒光定量pcr反應(yīng)試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如下表1所示。表1特異性引物和探針的核苷酸序列實(shí)施例2禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑盒2本檢測(cè)試劑盒中包含標(biāo)準(zhǔn)品、熒光定量pcr反應(yīng)試劑冷凍干燥粉、ddh2o、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。其中，標(biāo)準(zhǔn)品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒。熒光定量pcr反應(yīng)試劑冷凍干燥粉包含dntps、taq酶、緩沖鹽、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如上表1所示。陽(yáng)性對(duì)照品為含有禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的dna樣品，陰性對(duì)照品為不含有ha基因或該基因片段的dna樣品。實(shí)施例3禽流感病毒h7亞型檢測(cè)系統(tǒng)本檢測(cè)系統(tǒng)中包含核酸萃取試劑盒、檢測(cè)試劑盒、pockitmicro熒光pcr核酸分析儀、微型離心機(jī)和移動(dòng)電源。檢測(cè)試劑盒中包含標(biāo)準(zhǔn)品和熒光定量pcr反應(yīng)試劑。其中，標(biāo)準(zhǔn)品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒。熒光定量pcr反應(yīng)試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如上表1所示。實(shí)施例4禽流感病毒h7亞型檢測(cè)一、檢測(cè)對(duì)象經(jīng)實(shí)驗(yàn)室pcr方法確診的感染h7亞型禽流感病毒的家禽咽喉拭子為檢測(cè)樣本，未感染h7亞型禽流感病毒的家禽咽喉拭子作為陰性對(duì)照樣本。二、樣品核酸提取實(shí)驗(yàn)試劑：使用petnad核酸萃取試劑盒(金瑞鴻捷生物科技有限公司)，應(yīng)用純化管柱萃取系統(tǒng)。萃取試劑盒產(chǎn)品組成如下表2所示。表2萃取試劑盒產(chǎn)品組成品名體積注意事項(xiàng)：初次使用前pb136ml/瓶-pb21ml/瓶使用前加入35ml95％酒精pb320ml/瓶使用前加入20ml95％酒精pb415ml/瓶使用前加入25ml95％酒精pb512ml/瓶-純化管柱&收集管50組/袋-實(shí)驗(yàn)儀器：cubee微型離心機(jī)(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。提取方法：按照petnad核酸萃取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，提取樣品基因組dna，操作步驟如下：1、樣本的處理分別將檢測(cè)樣本和陰性對(duì)照樣本的咽喉拭子放置在含有1mldepc水或是生理鹽水中充分震蕩混合，丟棄拭子，置于微型離心機(jī)中先離心數(shù)秒，取200μl上清液備用。2、核酸提取(1)取600μlpb1加入上述離心管中，將離心管蓋上蓋子后，迅速地上下?lián)u動(dòng)1分鐘；(2)再加入600μlpb2(含酒精)，將離心管蓋上蓋子后，迅速地上下?lián)u動(dòng)10秒；(3)取600μl的混合溶液，加到純化管柱中；(4)離心1分鐘后，倒掉收集管內(nèi)液體；(5)加入600μlpb3(含酒精)到純化管柱中；(6)離心1分鐘，倒掉收集管內(nèi)液體；(7)加入600μlpb4(含酒精)到純化管柱中；(8)離心1分鐘，倒掉收集管內(nèi)液體；(9)再離心3分鐘，除去殘留乙醇；(10)丟掉收集管，將純化管柱套至新的離心管上；(11)在純化管柱中加入50μl的pb5，放置在室溫下1分鐘；(12)離心1分鐘后，丟棄純化管柱，所得核酸萃取物可以立即使用，或存放在4℃下1小時(shí)內(nèi)用完。三、pcr檢測(cè)采用絕熱恒溫聚合酶鏈反應(yīng)(iipcr)技術(shù)，在特殊設(shè)計(jì)的毛細(xì)管針對(duì)單點(diǎn)進(jìn)行恒溫加熱，然后利用熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)分析，并在45分鐘內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)儀器：pockitmicro熒光pcr核酸分析儀(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。目的基因：禽流感病毒h7亞型ha基因。標(biāo)準(zhǔn)品：包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質(zhì)粒。iipcr反應(yīng)體系如下表3所示。表3iipcr反應(yīng)體系體系成分濃度(終濃度)體積(μl)dntp25mm(0.5mm)1凍干buffer-6.3引物110μm(0.5μm)2.5引物210μm(0.5μm)2.5探針15μm(0.05μm)0.5探針25μm(0.05μm)0.5iipcrmmlvrtase4u/μl(8u)2.00rnaseinhibitor2u/μl(2u)1.00noglyceroltaq35unit/μl(26.25u)0.75ddh2o-加至50μl引物與探針：引物1序列：5'-gcttcggggcatcatgtt-3'(seqidno:1)；引物2序列：5'-gcaccgcatgtttccattctt-3'(seqidno:2)；探針1序列：5'-attgcaatgggccttgtc-3'(seqidno:3)；探針2序列：5'-attgcaatgggattggtt-3'(seqidno:4)。檢測(cè)步驟：1、標(biāo)準(zhǔn)品制備初次使用干燥標(biāo)準(zhǔn)品先用100μl標(biāo)準(zhǔn)品回溶液回溶，回溶后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在4℃條件下保存。2、樣本檢測(cè)(1)按照上表3所示的體系組成制備iipcr反應(yīng)液；(2)向三個(gè)裝有上述iipcr反應(yīng)液的pcr反應(yīng)管中分別加入5μl檢測(cè)樣本核酸萃取物、陰性對(duì)照樣本核酸萃取物和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，利用移液器反復(fù)吹吸混合均勻；(3)分別吸取50μl上述混合物移入r-tubetm；(4)將r-tubetm蓋上蓋子后，利用微型離心機(jī)將r-tubetm里的液體離心至管底；(5)啟動(dòng)檢測(cè)儀，待檢測(cè)儀完成自檢后將r-tubetm放入反應(yīng)槽中；(6)蓋上機(jī)器蓋子后，開(kāi)機(jī)啟動(dòng)擴(kuò)增程序并完成核酸檢測(cè)，結(jié)果將于反應(yīng)完成后顯示在lcd面板上。四、檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示：檢測(cè)樣本核酸萃取物和標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測(cè)結(jié)果均為“+”(陽(yáng)性)，陰性對(duì)照樣本核酸萃取物檢測(cè)結(jié)果為“－”(陰性)，說(shuō)明利用本檢測(cè)系統(tǒng)可對(duì)h7亞型禽流感病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，特異性好。實(shí)施例5禽流感病毒h7亞型檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度測(cè)試一、檢測(cè)對(duì)象將實(shí)施例4中包含禽流感病毒h7亞型ha基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒采用nanodrop2000精確定量，然后根據(jù)質(zhì)粒分子量計(jì)算摩爾量，制備出100、33、10和0拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品用于靈敏度測(cè)試。二、檢測(cè)方法iipcr反應(yīng)體系與檢測(cè)方法同實(shí)施例4。三、測(cè)試結(jié)果測(cè)試結(jié)果如下表4所示。表4禽流感病毒h7亞型檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度測(cè)試拷貝數(shù)(μl)重現(xiàn)性means/nsd1004/43.850.13334/43.440.45104/43.540.4400/41.010.04結(jié)果顯示：本檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10拷貝(4/4)。以上對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式和實(shí)施例作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式和實(shí)施例，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下作出各種變化。sequencelisting<110>金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司、北京華安瑞基生物科技有限公司<120>基于pockitmicro熒光pcr平臺(tái)的禽流感病毒h7亞型檢測(cè)試劑及應(yīng)用<130>2017<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gcttcggggcatcatgtt18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gcaccgcatgtttccattctt21<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3attgcaatgggccttgtc18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4attgcaatgggattggtt18當(dāng)前第1頁(yè)12