專利名稱：一種用防御素基因檢測昆蟲自殘率的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用防御素基因檢測昆蟲自殘率的方法。
背景技術：
害蟲生物防治在農林業可持續發展中發揮著不可替代的重要作用。天敵昆蟲的大量生產更是生物防治中最基礎也是最重要的環節。捕食性天敵昆蟲躅蝽(Armachinensis)可以控制來自鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多種農林害蟲，尤其是它還可以控制重大外來入侵害蟲馬鈴薯甲蟲和美國白蛾，因此躅蝽是一種應用前景很好的天敵昆蟲商品O作為商品，大量減少生產成本是人們追求利潤最大化的一個途徑。在天敵昆蟲躅蝽生產中就可以應用不同的食物來生產躅蝽，例如，不同的昆蟲獵物、含昆蟲成分的人工飼料和不含昆蟲成分的人工飼料，進而減少生產成本。但是應用不同的食物生產出來的躅蝽的生物學特性參差不齊，有些釋放后能達到很好的控制害蟲的作用，有的則在釋放后效果不顯著。由于不同食物飼喂的躅蝽在表型上很難區分，因此這些天敵昆蟲在釋放前是很難評估它們的生物學特性的。種內自殘現象是捕食性天敵昆蟲大量群體飼養過程中很嚴重的一個問題。自殘率高的昆蟲種群很難在短期內大量擴繁，因此倍增時間大大延長，進而增加飼養成本。在用人工飼料飼養的躅蝽種群內，自殘率較高。但是對于不同食物來源或不同商家的商品躅蝽自殘率的檢測方法仍舊是在飼養過程中測試其自殘率的多少，這種方法費時費力費錢。不進行生物學測定就很難對商品進行快速的檢測。防御素是蝽類防御競爭對手及躲避天敵的一種重要武器，防御素的大量釋放可以在天敵飼養過程中大大減少天敵昆蟲的自殘現象，而且在釋放天敵到野外或保護地防治害蟲時，可以減少天敵對躅蝽的危害。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于檢測類防御素蛋白編碼基因表達量的物質的用途。本發明提供了用于檢測類防御素蛋白編碼基因表達量的物質在檢測昆蟲自殘率中的應用；所述類防御素蛋白(defensin-like protein)的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應用中，所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群；所述昆蟲種群具體為取食不同物質昆蟲種群；所述取食不同物質昆蟲種群進一步具體為取食人工飼料的昆蟲種群或取食獵物的昆蟲種群；所述類防御素蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第81-272位核苷酸。所述昆蟲具體為躅蝽。
上述人工飼料按照如下方法制備生豬肝60g、大豆粉10g、水100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿O. 4g、泛酸韓8mg、葉酸O. lmg、煙酰胺O. 2mg、慶大霉素
3.9mg ;具體飼喂方法見實施例2 ；上述獵物為昨蠶(Antheraea pernyi)蛹；具體飼喂方法見實施例2。上述應用中，所述用于檢測類防御素蛋白編碼基因表達量的物質為如下I)-3)中任意一種I)引物對A :所述引物對由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物對A的RT-PCR試劑；3)含有所述引物對A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。本發明的另一個目的是提供一種引物對A。本發明提供的引物對A，由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4。含有上述的引物對A的RT-PCR試劑也是本發明保護的范圍；上述RT-PCR試劑具體由水、RT-PCR擴增緩沖液、鎂離子、dNTPs、上述的引物對A、熒光染料(SYBR GreenI)和Taq酶組成；所述引物對A中 的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為O. 2-1 μ Μ，所述引物對A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進一步具體為O. 25 μ M0含有上述的引物對A或上述的RT-PCR試劑的試劑盒也是本發明保護的范圍。上述試劑盒還包括內參引物對B，所述內參引物對B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發明的第三個目的是提供一種檢測昆蟲自殘率的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用上述的引物對A或上述的RT-PCR試劑或上述的試劑盒對待測的昆蟲A和B進行RT-PCR擴增；若所述昆蟲A的類防御素蛋白基因的表達量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A的自殘率低于所述昆蟲B。上述方法中，所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群； 所述RT-PCR擴增的模板為昆蟲的cDNA ；所述昆蟲具體為躅蝽。在本發明的實施例中，所述昆蟲A為取食獵物的昆蟲種群；所述昆蟲B為取食人工飼料的昆蟲種群。本發明的第四個目的是提供一種蛋白或其編碼基因。本發明提供的蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；本發明提供的蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第81-272位核苷酸。本發明的實驗證明，本發明所提供的檢測方法可以通過檢測類防御素蛋白基因表達量來檢測不同種群的昆蟲自殘率，特別是不同營養源的躅蝽的自殘率，用本發明的檢測方法檢測昆蟲的自殘率僅需2-3天。而用傳統的生物學方法需要30-60天左右。本發明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時，省力，適合于在昆蟲商品檢驗檢測中推廣應用。


圖1為躅蝽beta-actin內參擴增曲線圖2為躅蝽beta-actin內參融解曲線圖3為躅蝽類防御素蛋白基因擴增曲線圖4為躅蝽類防御素蛋白基因融解曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、檢測昆蟲自殘率的類防御素蛋白及其編碼基因的發現和專用引物的設計研究發現，防御素基因是一種檢測昆蟲自殘率的很好的分子標記，因此本發明通過檢測躅蝽的類防御素蛋白(defensin-like protein)編碼基因的表達來檢測躅蝽的自殘率。躅蝽的類防御素蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第81 -272位核苷酸，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。根據躅蝽的類防御素蛋白編碼基因設計用于擴增該編碼基因的引物如下上游引物TGCGCTAGTTCACGTGCCTT(序列 3 );下游引物AGCGGTACTGTCCCTAGGTAAT(序列 4)。實施例2、類防御素蛋白或其編碼基因或專用引物在檢測躅蝽自殘率中的應用下述實驗中米用的螞疇(Armachinensis,記載在 Taxonomic and bionomicnotes onArma chinensis (Fallou) (Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公眾可從中國農業科學院植物保護研究所獲得)根據取食物質的不同分為兩組，每組50只取食人工飼料組躅蝽飼喂人工飼料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每頭成蟲飼喂160微升人工飼料，一直到躅蝽自然死亡；取食獵物組躅蝽飼喂獵物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每對成蟲飼喂一頭獵物，每隔7-15天根據獵物被取食情況更換一次獵物，一直到躅蝽自然死亡；人工飼料為生豬肝60g、大豆粉IOgdjC 100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VC0. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸I丐8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素3. 9mg ；獵物為昨蠶(Antheraea pernyi )蛹(可商購)。一、躅蝽cDNA的獲得1、躅蝽RNA抽提步驟如下將各組躅蝽樣品移入加入適量液氮的研缽中，快速、用力研磨成勻漿，移至1.5ml
離心管中。
加1000 μ ITrizol到1. 5ml離心管中，靜置5分鐘。加200 μ I氯仿，旋渦振蕩10秒，靜置5分鐘，放入離心機中，12，000g4°C離心15分鐘。將上清液轉移至新的1. 5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，_20°C放置I小時，室溫靜置10分鐘。放入離心機中，12，000g，4°C離心10分鐘。棄上清液，將異丙醇除盡，加入Iml75%的無水乙醇，12，000g，4°C離心5分鐘。棄上清液，待沉淀干燥后加入DEPC處理水，_80°C保存，得到RNA。2、反轉錄米用SuperscripttOReverse Transcriptasekit 試劑盒(Invitrogenl8080044)進行反轉錄a)取一滅菌的無RNA酶的印pend·orf管，每個樣本加入如下表I所示的組分得到mixl ；表I為反轉錄加入組分I
權利要求
1.用于檢測類防御素蛋白編碼基因表達量的物質在檢測昆蟲自殘率中的應用； 所述類防御素蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群；所述類防御素蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第81-272位核苷酸； 所述昆蟲具體為躅蝽。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述用于檢測類防御素蛋白編碼基因表達量的物質為如下I) -3)中任意一種 1)引物對A:所述引物對由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 2)含有所述引物對A的RT-PCR試劑； 3)含有所述引物對A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。
4.一種引物對A，由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4。
5.含有權利要求4所述的引物對A的RT-PCR試劑Jy^iRT-PCR試劑具體由水、RT-PCR擴增緩沖液、鎂離子、dNTPs、權利要求4所述的引物對A、熒光染料和Taq酶組成； 所述弓I物對A中的各條弓I物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為O. 2-1 μ Μ,所述弓I物對A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進一步具體為O. 25 μ Μ。
6.含有權利要求4所述的引物對A或權利要求5所述的RT-PCR試劑的試劑盒。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內參引物對B，所述內參引物對B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。
8.—種檢測昆蟲自殘率的方法，包括如下步驟用權利要求4所述的引物對A或權利要求5所述的RT-PCR試劑或權利要求6或7所述的試劑盒對待測的昆蟲A和B進行RT-PCR擴增； 若所述昆蟲A的類防御素蛋白基因的表達量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A的自殘率低于所述昆蟲B。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群；所述RT-PCR擴增的模板為昆蟲cDNA ； 所述昆蟲為躅蝽。
10.一種蛋白或其編碼基因 所述蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ； 所述蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第81-272位核苷酸。
全文摘要
本發明公開了一種用防御素基因檢測昆蟲自殘率的方法。本發明提供了用于檢測取食不同物質的昆蟲種群的類防御素蛋白編碼基因表達量的物質在檢測取食不同物質的昆蟲種群自殘率中的應用；所述類防御素蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發明的實驗證明，本發明所提供的檢測方法可以用于檢測昆蟲自殘率，特別是不同營養源的蠋蝽的自殘率，用本發明的檢測方法檢測昆蟲的自殘率僅需2-3天。而用傳統的生物學方法需要30-60天左右。本發明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時，省力，適合于在昆蟲商品檢驗檢測中推廣應用。
文檔編號C12N15/12GK103060466SQ201310032089
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者鄒德玉, 陳紅印, 張禮生, 王樹英, 陳長風, 王孟卿, 劉晨曦 申請人:中國農業科學院植物保護研究所