專利名稱：一種雜合抗菌肽lpcb及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種雜合抗菌肽LPCB及其制備方法。
背景技術：
抗菌肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)是生物體內經誘導產生的小分子多肽，廣泛存在于多種生物體，是機體防御病原體入侵的第一道屏障。大多數抗菌肽都具有廣譜抗菌性，不僅可以抑制多種細菌或真菌，甚至對病毒及腫瘤細胞都有高效的殺傷活性。并且抗菌肽不易產生耐藥性，可作為傳統抗生素的替代品，近年來對抗菌肽的研究已成為一大熱點。但是由于抗菌肽分子小，直接從動植物體內提取分離效率較低，而化學合成的費用昂貴，因此利用基因工程手段對天然抗菌肽進行設計和改造，以獲得抗菌譜更廣、活性更強、減弱或消除其毒副作用的新型抗菌肽是一個理想的選擇。專利200910036902.X報道了一種雜合抗菌肽CA-MA的基因工程制備方法，該方法記載了利用家蠅泛素為融合伴侶，構建了高效表達雜合抗菌肽CA-MA的融合表達載體，所獲得的抗菌肽具有高效的抗菌活性和光譜性。但是該方法制備的雜合抗菌肽的溶血性沒有相關報道，CA-MA的安全性也備受質疑。另一方面大腸桿菌系統表達抗菌肽比較困難，主要表現在抗菌肽容易被降解，抗菌肽本身帶有大量的正電荷，對蛋白酶非常敏感，在大腸埃希菌中容易降解，難以實現量產。發明專 利200610085397.4報道了采用酵母表達系統進行基因工程抗菌肽類天蠶素A-馬蓋寧的制備,該方法記載了根據抗菌肽天蠶素A(cecropinA, CA) N端第1_7個氨基酸殘基，馬蓋寧(magainin, M)N端第2_12個氨基酸殘基，以畢氏酵母偏愛的密碼子設計合成雜合肽CA(1-7)-M(2-12)基因，轉化畢氏酵母SMD1168，在醇氧化酶啟動子調控下，分子量1.9KD的CecA-Mag雜合抗菌肽獲得表達。然而由于天蠶素A的細胞溶血性較強，存在安全性問題，不適合后續的生產應用。而該專利也沒有報道所制備的雜合抗菌肽的溶血性效果O

發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提供一種雜合抗菌肽LPCB，該雜合抗菌肽LPCB具有較高的抑菌活性及熱穩定性，并且溶血性低，安全性得到大大提高。本發明的另一目的在于提供一種上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法。為了達到上述發明目的，本發明采用的一個技術方案是:提供一種雜合抗菌肽LPCB，其特征在于:它為以下氨基酸序列:RRffQffR(P)nKffKIFKKIEK ；其中，η表示脯氨酸的個數，η = I 10。所述雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成，它所對應的核苷酸序列為: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGMGATGGCAATGGAGA (CCA) nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3 ;其中，n表示脯氨酸密碼子的個數，η = 3 30。上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法，包括:雜合抗菌肽LPCB的基因改造及克隆:參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與PPICZ a -A相連接獲得表達載體pPICZ a -A-LPCB,并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體；雜合抗菌肽LPCB真核表達載體的構建:將測序正確的表達載體pPICZ a -A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris X_33,經甲醇誘導表達,獲得雜合抗菌肽LPCB ;采用甲醇進行誘導表達的條件為:在25°C下，每24 36h向培養基中添加
0.2 0.5%的甲醇，誘導表達72 96h。其中，在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) ^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 3 30, η表示脯氨酸密碼子的個數。綜上所述:本發明提供的雜合抗菌肽LPCB具有良好的抑菌活性及熱穩定性，并且溶血性低，即使是高濃度的雜合抗菌肽對紅細胞也幾乎沒有破壞作用，安全性得到大大提高；且該雜合抗菌肽LPCB制備方法簡單，易純化，利于大規模生產。


圖1為雜合抗菌肽LPCB的熱穩定性的示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細的描述，但它們不是對本發明的進一步限制。實施例1本發明的雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成；該雜合抗菌肽LPCB的核心序列為:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的個數，η = I ；雜合抗菌肽LPCB所對應的核苷酸序列為:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 3，η表示脯氨酸密碼子的個數；該雜合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的個數為I及核苷酸序列中脯氨酸密碼子的個數為3，以增強該雜合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法為:參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與pPICZ a -A相連接獲得表達載體pPICZ a -A-LPCB,并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體；在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3
其中，Ii1 = n2 = 3, η表示脯氨酸密碼子的個數。再將測序正確的表達載體pPICZ a -A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每24h向培養基中添加0.2%的甲醇，誘導表達72h，獲得雜合抗菌肽LPCB，該雜合抗菌肽LPCB的表達量可達78 μ g/mL。經活性初測表明，該雜合抗菌肽LPCB具有較好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析結果顯示:雜合抗菌肽LPCB蛋白分子量約為2.4kDa，與預期結果相符。實施例2本發明的雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成；該雜合抗菌肽LPCB的核心序列為:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的個數，η = 10 ；雜合抗菌肽LPCB所對應的核苷酸序列為:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 30，η表示脯氨酸密碼子的個數；該雜合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的個數為10及核苷酸序列中脯氨酸密碼子的個數為30，以增強該雜合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法為:參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與pPICZ a -A相連接獲得表達載體pPICZ a -A-LPCB,并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體；在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為: F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 30, η表示脯氨酸密碼子的個數。再將測序正確的表達載體pPICZ a -A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每36h向培養基中添加0.5%的甲醇，誘導表達96h，獲得雜合抗菌肽LPCB，該雜合抗菌肽LPCB的表達量可達96 μ g/mL。經活性初測表明，該雜合抗菌肽LPCB具有較好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析結果顯示=LPCB蛋白分子量約為3.5kDa，與預期結果相符。實施例3本發明的雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成；該雜合抗菌肽LPCB的核心序列為:RRffQffR(P) nKWKIFKKIEK, η 表示脯氨酸的個數，η = 5 ；雜合抗菌肽LPCB所對應的核苷酸序列為:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3，η = 15，η表示脯氨酸密碼子的個數；該雜合抗菌肽LPCB的氨基酸序列中脯氨酸的個數為5及核苷酸序列中脯氨酸密碼子的個數為15，以增強該雜合抗菌肽LPCB的抑菌活性；上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法為:參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因， 并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與pPICZ a -A相連接獲得表達載體pPICZ a -A-LPCB,并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體；在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為:F3: 5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA (CCA) r^AAGTGGAAGA-3F4: 5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3其中，Ii1 = n2 = 15, η表示脯氨酸密碼子的個數。再將測序正確的表達載體pPICZ a -A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris X-33，在25°C下，每30h向培養基中添加0.3%的甲醇，誘導表達84h，獲得雜合抗菌肽LPCB，該雜合抗菌肽LPCB的表達量可達73 μ g/mL。經活性初測表明，該雜合抗菌肽LPCB具有較好的抗菌性；小肽Tricine-SDS-PAGE分析結果顯示=LPCB蛋白分子量約為2.9kDa，與預期結果相符。試驗例將上述實施例3的雜合抗菌肽LPCB分別進行抑菌活性、熱穩定性及溶血性檢測:1、抗菌譜測定實驗表明(表I):雜合抗菌肽LPCB對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均顯示出良好的抑菌性，尤其是對Salmonella derby的抑菌效果更為明顯；表I雜合抗菌肽LPCB的抗菌譜

權利要求
1.一種雜合抗菌肽LPCB，其特征在于:它為以下氨基酸序列: RRffQffR(P)nKWKIFKKIEK ;其中，η表示脯氨酸的個數，η = I 10。
2.根據權利要求1所述的雜合抗菌肽LPCB，其特征在于:所述雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成,它所對應的核苷酸序列為:5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3 ;其中，η表示脯氨酸密碼子的個數，η = 3 30。
3.一種雜合抗菌肽LPCB的制備方法,其特征在于,包括: 雜合抗菌肽LPCB的基因改造及克隆:參照畢赤巴斯德酵母的偏好密碼子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與pPICZ a -A相連接獲得表達載體pPICZ a -A-LPCB,并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體； 雜合抗菌肽LPCB真核表達載體的構建:將測序正確的表達載體pPICZ a -A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia pastoris X_33,經甲醇誘導表達,獲得雜合抗菌肽LPCB ； 其中，在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為:F3:5-CCCTCGAGAAAAGAA GAAGATGGCAATGGAGA(CCA)riiAAGTGGAAGA-3F4:5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT (TGG) n2TCTCCATTGCC_3 其中，Ii1 = n2 = 3 30, n表示脯氨酸密碼子的個數。
4.根據權利要求3所述的雜合抗菌肽LPCB的制備方法，其特征在于，采用甲醇進行誘導表達的條件為:在25°C下，每24 36h向培養基中添加0.2 0.5%的甲醇，誘導表達72 96h，獲得雜合抗菌肽LPCB。
全文摘要
本發明公開了一種雜合抗菌肽LPCB及其制備方法，該雜合抗菌肽的氨基酸序列為RRWQWR(P)nKWKIFKKIEK，并且脯氨酸的個數為1～10；該雜合抗菌肽在制備過程中采用引物F3和F4，且該引物中n為3～30；本發明的雜合抗菌肽LPCB具有良好的抑菌活性及熱穩定性，并且溶血性低，即使是高濃度的雜合抗菌肽對紅細胞也幾乎沒有破壞作用，安全性得到大大提高；且該雜合抗菌肽LPCB制備方法簡單，易純化，利于大規模生產。
文檔編號C12N15/81GK103145805SQ20131003215
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者曹毅, 喬代蓉, 徐輝 申請人:曹毅, 喬代蓉, 徐輝