專利名稱：一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
最近幾年，藥物遺傳學/藥物基因組學在抗腫瘤藥物作用機制等方面的研究獲得了突破性進展，發現某些抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷效應與特定的一種(或一組)基因的表達和/或多態性顯著相關。通 過相關基因的檢測，預測化療及靶向藥物的療效，選擇合適的藥物進行個體化化療，已經成為提高療效、減少無效治療的合理選擇。個體化治療是根據患者的遺傳學特點，采用特異和最佳的藥物方案進行治療的方法。大量臨床數據表明，腫瘤組織中ERCC1/RRM1/TYMS/TUBB3等靶標基因mRNA表達水平可以分別預測患者對鉬類/吉西他濱/氟尿嘧啶類/抗微管類等常用化療藥物的反應。根據患者腫瘤組織中mRNA表達水平的檢測結果，制訂個體化治療方案，有助于選擇適合患者的化療藥物，提高治療的針對性。通過靶標檢測選擇化療藥物可以避免無效或有害的化療、節省寶貴的治療時間與治療費用。目前檢測基因表達(mRNA水平)的方法主要為熒光定量PCR法。熒光定量PCR通過設計特異性的探針序列，經實時定量PCR對目的基因的表達水平進行定量檢測。熒光定量PCR具有較高的靈敏度與準確性，可精確定量，操作簡單快捷，是當前基因定量檢測的主流方法。但是，熒光定量PCR的如下不足限制了它的市場應用:(1)通量低:一次反應只能檢測一個基因，對于復雜的藥物代謝和調控系統，需要檢測多個位點時，就需要多臺PCR儀同時工作，效率低，周期長。(2)多個位點檢測成本較高:需要進行多個反應才能得到所需的基因表達信息，從而使總的檢測成本較高。(3)難以設置內參基因:只能設置外控基因，無法有效的監測RNA質量及整個反應系統。GenomeLab GeXP多重基因表達遺傳分析系統基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的激光誘導熒光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標記,在同一個EP管中同時分析多個基因的表達,能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述熒光定量PCR法存在的缺陷，具有以下優點:1、高通量:本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。2、準確性強=GeXP采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結果重復性好:GeXP系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超聞靈敏度；4、方法簡便，使用經濟=GeXP提供從試劑、多重PCR引物設計、結果及定量表達譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規模推廣；5、精確定量、靈活性強:可精確定量病原體基因拷貝數，可隨時根據需求調整檢測的靶基因。6、易于實現自動化:就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準確的樣品追蹤和結果報
生口 o目前，國內外還沒有關于基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法的相關研究報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒，包括DEPC水、5XRT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液，10XPCR緩沖液，PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，所述的反轉錄引物包括以下表I中14種抗 腫瘤用藥相關基因的RT擴增引物及RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括以下表I中14種抗腫瘤用藥相關基因的PCR擴增引物、RNA內參的PCR擴增引物及DNA內參的正反向PCR擴增引物，基因序列如下表I所示:表I
權利要求
1.一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒，包括DEPC水、5XRT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液，IO X PCR緩沖液，PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于所述的反轉錄引物包括以下表中14種抗腫瘤用藥相關基因的RT擴增引物及RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括以下表中14種抗腫瘤用藥相關基因的PCR擴增引物、RNA內參的PCR擴增引物及DNA內參的正反向PCR擴增引物，基因序列如下表所示:
2.根據權利要求1所述的一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向引物帶熒光標記。
3.根據權利要求1所述的一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品為上述14種抗腫瘤用藥相關基因、RNA內參及反應內參的引物克隆所得DNA片段。
4.一種利用權利要求1-3中任一項所述的同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提 取核酸 采集患者腫瘤組織的分離培養物，從分離培養物中提取核酸； (2)以患者核酸為模板進行RT反應 取5-20ng/ul的核酸樣品RNA5 u L，DEPC水8 y L，5 X RT緩沖液4 y L，RT引物溶液2 y L，RT酶Iii L混勻后加入到96孔樣品板上進行反轉錄，反應條件:48° Cl分鐘；42° C60分鐘；95° C5分鐘；4° C直至收取RT產物；其中RT引物溶液中各RT引物濃度均為500nM，所述的RT引物包括14種抗腫瘤用藥相關基因的RT擴增引物及RNA內參的RT擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1 N0.18所不； (3)以反轉錄產物為模板進行PCR反應 取RT產物 8.6 ii L，10 X PCR緩沖液2 y L，25mM的氯化鎂4 y L，PCR引物溶液2 y L，DNA聚合酶1.4 ii L，X溶液2 ii L混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:95° ClO分鐘；94° C30秒鐘，55° C30秒鐘，70° Cl分鐘，循環35次；70° Cl分鐘；4° C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向引物帶熒光標記，PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，PCR引物包括14種抗腫瘤用藥相關基因的PCR擴增引物、RNA內參的PCR擴增引物及DNA內參的正反向PCR擴增引物，基因序列如序列表中SEQ IDN0.19 N0.38所示； (4)GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品取PCR產物0.1-luL, GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75 u L, DNA標準品0.5u L,礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將GeXP遺.傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標準圖譜對比，獲得抗腫瘤用藥相關基因表達水平。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測14種抗腫瘤用藥相關基因表達水平的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括DEPC水、5×RT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液、10×PCR緩沖液、PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，上述反轉錄引物包括14種抗腫瘤用藥相關基因的RT擴增引物及RNA內參的RT擴增引物，基因序列如SEQ ID NO.1-NO.18所示，PCR引物包括14種抗腫瘤用藥相關基因的PCR擴增引物、RNA內參的PCR擴增引物及DNA內參的正反向PCR擴增引物，基因序列如SEQ ID NO.19-NO.38所示，優點是特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
文檔編號C12Q1/68GK103074435SQ20131003324
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者南麗, 顏進, 徐冰, 王晴晴, 吳勇 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司