專利名稱：一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
5-FU類藥物屬抗代謝類化療藥中的氟尿嘧啶類，這些藥物在體內均轉化為5-FU，抑制脫氧胸苷酸合成酶，從而影響DNA的合成，達到抑制腫瘤的生長的目的。因此該類藥物的使用不可避免地損傷患者體內正常的細胞分裂，出現諸多的化療副作用。5-FU類藥物的抗癌譜很廣，是使用最為廣泛的抗腫瘤藥物之一。但在5-FU類藥物的臨床應用中，卻存在治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異，部分患者獲益，部分患者耐藥并出現嚴重毒副作用。研究表明，人群對5-FU的個體差異與單核苷酸多態性(SNP)密切相關。腫瘤患者在接受5-FU類藥物化療之前，進行5-FU類藥物相關SNP基因位點的監測，根據監測結果制定化療方案，提高腫瘤臨床治療的針對性，減少藥物毒副作用的發生，節約寶貴的醫治時間。現有的指導5-氟尿嘧啶用藥的單核苷酸多態性(SNP)診斷方法主要為基因芯片法、熒光定量PCR (qPCR)和Sanger測序法。(l)qPCR檢測方法:采用熒光淬滅及雙末端標記技術，針對SNP位點變異設計特異性的探針。其優點是靈敏度高、準確性強。其缺點是(I)通量低:不適宜多SNP位點的檢測；難以設置內控基因。(2)成本較高:探針標記成本高；若需獲得所有相關SNP信息，需進行多個檢測試驗，疊加成本更加昂貴。(2)基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等優點在SNP檢測中得到大量應用，依靠野生型與突變型基因雜交動力學的差異對突變位點進行檢測。其優點是:(1)高通量并行檢測；(2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。缺點:1)不同SNP位點之間的雜交動力學差異不同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制；2)技術成本昂貴、復雜:每個樣品需要一個芯片，成本大于Y1000/樣品，不利于大規模推廣；探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)重復性差，準確性低，易出現假陽性假陰性結果；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。 (3)Sanger (雙脫氧鏈終止法)測序法:Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。其優點是SNP分析金標準，能發現已知SNP，也能發現未知SNP。缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，多個SNP位點檢測累計價格相對昂貴。Gen0meLabTMGeXP多重基因表達遺傳分析系統基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的激光誘導熒光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標記,在同一個EP管中同時分析多個基因的表達,能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下優點:1、高通量:本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。2、準確性強:GeXP采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結果重復性好:GeXP系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超聞靈敏度；4、方法簡便，使用經濟:GeXP提供從試劑、多重PCR引物設計、結果及定量表達譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規模推廣；5、精確定量、靈活性強:可精確定量病原體基因拷貝數，可隨時根據需求調整檢測的靶基因。6、易于實現自動化:就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準確的樣品追蹤和結果報
告目前，國內外還沒有關于基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的指導5_氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法的相關研究報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒，包括超純水(ddH20)，X溶液，10XPCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，所述的PCR引物包括以下6個與5-氟尿嘧啶用藥相關基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下表I所示:表I
權利要求
1.一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒，包括超純水，X溶液，IOXPCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下6個與5-氟尿嘧啶用藥相關基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增弓丨物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其核酸序列如下:
2.根據權利要求1所述的一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。
3.根據權利要求1所述的一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品為上述6個與5-氟尿嘧啶用藥相關基因上的7個SNP位點上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
4.一種利用權利要求1-3中任一項所述的指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集腫瘤患者口腔拭子或血液樣品，從中提取核酸； (2)以提取的核酸為模板進行PCR反應 取DNA樣品2 μ L，10XPCR緩沖液2 μ L，25mM的氯化鎂3.4 μ L，PCR引物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超純水10 μ L混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:95° Cl分鐘；94° C30秒鐘，60° C30秒鐘，70° Cl分鐘，循環35次；70° Cl分鐘；4° C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增弓I物序列為AGGTGACACTATAGAATA ；反向擴增弓I物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記；PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括以下6個與5-氟尿嘧啶用藥相關基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1 N0.32所示； (3)GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品取PCR產物0.1-1 μ L，Beckman GeXP系統配套的上樣緩沖液38.75 μ L，DNA標準品0.5 μ L,礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品,將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標準圖譜對比，獲得指導5-氟尿嘧啶用藥相關基因的SNP位點的等位基因型。
全文摘要
本發明公開了一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，特點是PCR引物包括以下6個與5-氟尿嘧啶用藥相關基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內參的正反向擴增引物及反應內參的正反向擴增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.32所示；其檢測包括采集樣本并提取核酸的步驟；以提取的核酸為模板進行PCR反應的步驟；最后GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品的步驟，優點是特異性強、準確度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
文檔編號C12Q1/68GK103074436SQ20131003326
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者南麗, 顏進, 王晴晴, 吳勇 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司