專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌fqs38及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株生防菌及其應(yīng)用，即解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38及其對(duì)番爺?shù)拇偕饔煤头瑺攦煞N重要細(xì)菌土傳病害(青枯病和髓部壞死病)的防控作用。
背景技術(shù)：
設(shè)施番茄種植在我國農(nóng)業(yè)及農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的地位和作用越來越重要，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的支柱產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收的重要途徑。近年來，由單一品種重茬連作的種植模式引起的土傳病害(枯萎病、青枯病、細(xì)菌性髓部壞死和根腐病等)連作障礙頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重威脅設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。土傳病害發(fā)生的主要原因是設(shè)施蔬菜連作導(dǎo)致病原菌菌量增加，根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)被破壞、有益菌大幅度減少，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分比例和數(shù)量嚴(yán)重失調(diào)。目前，生產(chǎn)上防治設(shè)施蔬菜土傳病害主要依靠化學(xué)農(nóng)藥和傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)方法(如水旱輪作，高溫悶棚等)，然而，化學(xué)防治易增加蔬菜農(nóng)產(chǎn)品有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留，造成設(shè)施生態(tài)環(huán)境污染，對(duì)人類健康帶來嚴(yán)重危害；傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)方法雖有一定效果，但受到地利和種植模式的限制。為了平橫蔬菜品質(zhì)和產(chǎn)量之間的關(guān)系，達(dá)到有效控制土傳病害的發(fā)生和傳播、生態(tài)修復(fù)連作障礙、提高產(chǎn)量，保證果蔬品質(zhì)的目的，綠色，環(huán)境兼容性好的生物防控技術(shù)越來越受到國內(nèi)外科研人員的關(guān)注。Silveria等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):生防細(xì)菌蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)和凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)等3種芽孢桿菌對(duì)番茄青枯病有很好的防效，同時(shí)還可以提高番茄種子的發(fā)芽率。馬利平等經(jīng)過8年系統(tǒng)試驗(yàn)研究從330個(gè)細(xì)菌菌株中篩選出I株蠟質(zhì)芽孢桿菌98-1，可以有效防治番茄土傳病害-枯萎病菌的發(fā)生及傳播。國內(nèi)外關(guān)于生物防治的研究，微生物防治植物病害的主要機(jī)理有:1)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，直接抑制植物病原菌；2)與病原菌形成空間位點(diǎn)或營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的微生態(tài)關(guān)系；3)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性或抗蟲性。生物防治可能是以上介紹的一種或幾種機(jī)制 共同作用的結(jié)果，不同的生防菌株作用機(jī)制也不盡相同。近年來大量研究表明，土傳病害的發(fā)生和植物根際微生物種群結(jié)構(gòu)、密度密切相關(guān)。Peng等研究發(fā)現(xiàn):根圍細(xì)菌密度的增加可以抑制土壤中香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense的繁殖。吳鳳芝等研究發(fā)現(xiàn)，提高土壤微生物群落的多樣性可降低黃瓜角斑病、白粉病、霜霉病和枯萎病的病情指數(shù)和尖孢鐮刀菌的數(shù)量，提高黃瓜產(chǎn)量。通過引入有益生防微生物，改善作物根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量已經(jīng)成為防治土傳病害的主要途徑之
o番爺青枯病(病原菌為爺青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum)和髓部壞死病(病原菌為皺縮假單胞菌Pseudomonas corrugata)是設(shè)施番爺生產(chǎn)中的兩種主要細(xì)菌土傳病害。這兩種細(xì)菌性病害多發(fā)于番茄第一序花開花期及坐果階段，隨著坐果及果實(shí)膨大，病情逐漸加重。青枯病病原菌侵染維管束，阻塞其輸送營養(yǎng)物質(zhì)，病莖縱切面維管束變褐；而髓部壞死病菌主要侵染番茄莖髓部，變褐色并分解，阻礙水分及營養(yǎng)的輸送。細(xì)菌性病害引起相似的青枯病癥給兩種病害的診斷和防治帶來了很大難題。已報(bào)道的青枯病生防菌劑主要有無致病力青枯菌和芽孢桿菌等，而髓部壞死病害相關(guān)生防菌劑報(bào)道甚少，且目前所報(bào)道的生防菌劑都是以單一病害為作用靶標(biāo)，對(duì)兩種病害不能兼顧，生產(chǎn)上經(jīng)常發(fā)生用藥不當(dāng)，從而導(dǎo)致防效不佳。解決這個(gè)問題的途徑之一就是:以番茄青枯病菌和髓部壞死病菌為靶標(biāo)菌，篩選、鑒定對(duì)番茄有促生作用，且對(duì)兩種病原菌皆具拮抗作用的生防菌劑，并進(jìn)行田間應(yīng)用。江蘇省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所生物防治研究室從江蘇省的連云港、徐州的仰徐村、豐縣、南京六合及其郊區(qū)后村等地的番茄、辣椒和梨樹等作物根際采集土壤40份，分離純化獲得302個(gè)不同菌落形態(tài)細(xì)菌分離物。篩選獲得對(duì)番茄青枯病和髓部壞死病害有良好防效且促進(jìn)番爺生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)FQS38
發(fā)明內(nèi)容
: 本發(fā)明的目的在于:針對(duì)設(shè)施番茄重茬連作引起的重要土傳病害，尤其是細(xì)菌性土傳病害(番茄青枯病和髓部壞死病)發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，化學(xué)防治易造成環(huán)境污染，降低果品品質(zhì)等情況，提出一種解淀粉芽孢桿菌菌株FQS38及其在對(duì)番茄的促生作用和兩種細(xì)菌性土傳病害防治上的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株FQS38,其特征在于:FQS38菌株?duì)I養(yǎng)體為桿狀,兩端橢圓，周生鞭毛，無莢膜。芽孢中生。該菌在YPGA平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落邊緣波浪形，米白色，表面有皺褶。質(zhì)地為不透明狀，不產(chǎn)生色素。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) FQS38革蘭氏反應(yīng)陽性。H2O2酶反應(yīng)陽性，V.P.反應(yīng)陽性。D-葡萄糖利用為陽性。淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鈉利用、反應(yīng)也均為陽性。最佳生長(zhǎng)溫度30-37°C，55°C以上不生長(zhǎng)。該菌株16SrDNA序列比對(duì)與解淀粉芽孢桿菌同源性達(dá)99%，序列登陸NCBI網(wǎng)站，登陸號(hào)為:KC439673。所述YPGA培養(yǎng)基配方為:酵母膏5.0g,胰蛋白胨5.0g,葡萄糖5.0g,瓊脂17.0g,水 1000ml, pH6.8-7.2。本發(fā)明提供了一種生防菌劑，其中有效活性成分由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38組成,該菌株具有在番爺根部定殖擴(kuò)展的能力和促進(jìn)番爺生長(zhǎng)的作用。本發(fā)明所述的生防菌劑，其次生代謝產(chǎn)物中包括蛋白水解酶、纖維素酶和嗜鐵素等抗菌相關(guān)物質(zhì)，同時(shí)也包括植物生長(zhǎng)素(IAA)，赤霉素(GA3)等促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素。本發(fā)明所述生防菌劑是水劑，其配比成分主要是:解淀粉芽孢桿菌FQS38發(fā)酵液(菌含量為 I X 1010-2X 1010cfu/mL)，防腐劑 0.1% -0.5%, pH5.0-6.0。本發(fā)明所述的生防菌劑的用途是:防治設(shè)施番茄細(xì)菌性土傳病害，將所述的生防菌劑稀釋10倍后在番茄定植時(shí)灌入根部，隨后按照水肥規(guī)律進(jìn)行后續(xù)灌根用于防治番茄青枯病和髓部壞死病。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明涉及的解淀粉芽孢桿菌FQS38對(duì)番茄細(xì)菌性土傳病害具有良好防治效果，同時(shí)能夠促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)，無毒無致病性，對(duì)人畜安全、不污染環(huán)境，具有在田間番茄生產(chǎn)潛在的應(yīng)用可能性。生防菌劑在番茄根圍的使用能夠影響周圍環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及種類，惡化病原菌生存環(huán)境，形成一個(gè)生物多樣化的番茄生態(tài)系統(tǒng)，從而有效，持續(xù)地控制番茄細(xì)菌性土傳病害的流行和傳播。


:圖1解淀粉芽孢桿菌FQS38產(chǎn)生相關(guān)抗菌物質(zhì)(a，蛋白酶；b，纖維素酶；C，嗜鐵素)圖2解淀粉芽孢桿菌FQS38在番茄根部定殖作用(番茄根周圍為FQS38定殖區(qū))
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1解淀粉芽孢桿菌FQS38的分離、鑒定2011年9月，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株是在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地設(shè)施番茄根圍土壤中，通過梯度稀釋法分離獲得。具體方法是:采集好的根圍土壤IOg,加入90mL 滅菌水三角瓶中，震蕩培養(yǎng)30min(150rpm/min),制成1: 10 ( 土壤:水)懸浮液，然后去懸浮液lmL，置于9mL無菌水三角瓶中，以此類推，制成10_5，10_6稀釋液；在其中各取330ul，涂布YPGA平板，每個(gè)處理重復(fù)3次。將上述平板置于28°C恒溫培養(yǎng)2d，挑取單菌落轉(zhuǎn)至YPGA平板劃線純化，純化菌株于_70°C甘油保存。分離菌株在YPGA平板上培養(yǎng)時(shí)，菌落邊緣波浪形，米白色，表面有皺褶，質(zhì)地為不透明狀，不產(chǎn)生色素。菌株?duì)I養(yǎng)體為桿狀，兩端橢圓，周生鞭毛，無莢膜。芽孢中生。革蘭氏染色反應(yīng)陽性，需氧生長(zhǎng)，H202酶反應(yīng)陽性，V.P.反應(yīng)陽性，D-葡萄糖利用為陽性，淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽利用也均為陽性。最佳生長(zhǎng)溫度30-37°C，55°C以上不生長(zhǎng)。該菌株16S rDNA序列比對(duì)與解淀粉芽孢桿菌同源性達(dá)99%，序列登陸NCBI網(wǎng)站，登陸號(hào)為:KC439673。該菌株我們命名為FQS38，分類地位為:解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。實(shí)施例2解淀粉芽孢桿菌FQS38對(duì)番茄青枯病菌和髓部壞死病菌的抑制作用。供試病原菌菌株:番爺青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番爺髓部壞死病菌(Pseudomonascorrugata)均由江蘇省農(nóng)科院植保所生防室分離保存。番茄青枯病菌用NA培養(yǎng)基(牛肉浸膏3.0g,酵母膏Ig,蛋白胨5g,葡萄糖IOg,瓊脂20g,蒸懼水IOOOmL) 28。。振蕩(150rpm/min)培養(yǎng)2d，備用。番茄髓部壞死病菌用KB培養(yǎng)基(蛋白胨20g，甘油10mL，磷酸氫二鉀
1.5g，七水硫酸鎂1.5g，水IOOOmL,固體培養(yǎng)基需加瓊脂15g)培養(yǎng)2d，備用。將江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) FQS38在YPGA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后移入50mL YPGA液體培養(yǎng)液中，在28°C下振蕩(150rpm/min)培養(yǎng)2d，備用。吸取已制備好的青枯菌液和髓部壞死病菌涂布NA平板(0.1mL菌液/平板)，制成病菌平板，隨后在平板中成十字架形放置4張滅菌濾紙片，濾紙片上加入不同量的解淀粉芽孢桿菌FQS38菌液；設(shè)清水對(duì)照。每處理重復(fù)3皿。28°C恒溫培養(yǎng)2d，測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)結(jié)果見表I。表I解淀粉芽孢桿菌FQS38對(duì)番茄青枯病菌和髓部壞死病菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種生防菌劑，其中有效活性成分由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38 組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生防菌劑，其中，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38可以分泌蛋白酶、纖維素酶、嗜鐵素、植物生長(zhǎng)素IAA和赤霉素GA3等抗菌、促生相關(guān)物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生防菌劑，其中，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FQS38可以有效在番爺根部定殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的生防菌劑，其特征在于，它是水劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌劑，其中水劑各組分的重量百分比為: 解淀粉芽孢桿菌FQS38發(fā)酵液中菌含量 IX IO10-2X1010 cfu/mL 防腐劑0.1%—0.5%水余量 pH5.0-6.0
6.一種權(quán)利要求1-5所述的生防菌劑的用途，其特征在于:將所述的生防菌劑稀釋后灌入番茄根部用于防治土傳病害。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生防菌劑的應(yīng)用，其特征在于:所述的生防菌劑可以同時(shí)防治茄果類蔬菜兩種重要土傳病害(枯萎病和青枯病)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的生防菌劑的應(yīng)用，其特征在于:生防菌劑使用時(shí)的有效菌含量為 106-108cfu/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生防菌劑，其中有效活性成分由解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)FQS38組成。其特征在于該菌株具有在番茄根部定殖、促進(jìn)番茄生長(zhǎng)和防治土傳病害的作用；同時(shí)，該生防菌劑能夠分泌蛋白酶、纖維素酶、嗜鐵素、植物生長(zhǎng)素和赤霉素等抗菌、促生物質(zhì)。本發(fā)明所述生防菌劑是水劑，其配比成分主要是解淀粉芽孢桿菌FQS38發(fā)酵液(菌含量為1×1010-2×1010cfu/mL)，防腐劑0.1％-0.5％，pH5.0-6.0。將生防菌劑稀釋后在番茄定植時(shí)灌入根部，用于防治番茄青枯病和髓部壞死病，隨后按照水肥規(guī)律進(jìn)行后續(xù)灌根。成品藥劑稀釋后的有效菌含量為106-108cfu/mL。其優(yōu)點(diǎn)是FQS38對(duì)番茄細(xì)菌性土傳病害具有良好防治效果，能夠促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)，無毒無致病性，對(duì)人畜安全、環(huán)境友好，具有在田間生產(chǎn)應(yīng)用的可能性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103087960SQ201310033269
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者喬俊卿, 劉郵洲, 梁雪杰, 聶亞鋒, 陳志誼, 劉永鋒 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院