專利名稱：產(chǎn)電基因工程菌的構建、菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種產(chǎn)電基因工程菌的構建、菌株及其應用。
背景技術：
微生物燃料電池(microbial full cells，MFCs)是一種利用微生物作為生物催化劑將生物質(zhì)化學能轉化為電能的裝置，生活和工業(yè)污廢水中含有的豐富有機物就可以作為其原料來源，從中直接獲取電能。微生物電池除了具有很高的能量轉化效率外，還有其他燃料電池不具備的若干特點:①燃料來源多樣化；②操作條件溫和；③無污染，可實現(xiàn)零排放；④無需能量輸入；⑤能量利用的高效性；⑥生物相容性。因此，微生物燃料電池的研究已經(jīng)成為治理和消除環(huán)境污染源，開發(fā)新型能源，是新能源研究工作者的關注熱點。電子傳遞體是MFC的產(chǎn)電機制之一，它經(jīng)常被加入到MFC中，從而使細菌甚至酵母能傳遞電子。通過細胞色素蛋白直接接觸進行的電子傳遞只能在細胞與電子受體直接接觸或者納米級的距離內(nèi)進行，而事實上，金屬異化還原均可以在一定距離外進行，預示這些微生物可以分泌可溶性電子介體類物質(zhì)還原不溶性電子受體，這使得電子中介體成為近年來的MFC研究熱點之一。研究者曾使用多種電子中介體促進電子從胞內(nèi)向胞外的電子傳遞。這些外源中介體包括中性紅、2，6_蔥醌、鐵氰化鉀、甲基紫精。常見的內(nèi)生電子中介體有醌類物質(zhì)、綠膿素吩嗪類色素等。關于綠膿素化合物的產(chǎn)生原因還不是完全清楚，可能是由于外源電子傳遞的機 制或其他原因產(chǎn)生。這些化合物也具有抗生素特性。因此，分泌這些化合物的主要原因可能是作為呼吸作用的抑制劑或阻止其他競爭者生長。銅綠假單胞菌是產(chǎn)電子傳遞體的主要微生物之一，其主要的產(chǎn)電機制即為產(chǎn)生綠膿素作為電子傳遞體。綠膿素作為有效的電子傳遞介體，具備了以下特性:(I)為親水性的物質(zhì)；(2)氧化還原電位要與生物體電子傳遞鏈的氧化還原電位(NADH的氧化還電位是-0.32V)相匹配；(3)在電極上的氧化還原反應速率非常快，且有很好的可逆性。因此人為提高銅綠假單胞菌中綠膿素的量是提高純菌產(chǎn)電量的有效措施。目前關于銅綠假單胞菌在MFC中應用的文獻報道主要集中在綠膿素上。Rabaey等從微生物燃料電池中分離出銅綠假單胞菌，其能夠代謝出吩嗪類色素，該類物質(zhì)(如綠膿菌素)具有電化學活性，能夠提高某些細菌的功率輸出。目前有研究報道在微生物燃料電池中，以綠膿桿菌為主的混合菌作為微生物源能產(chǎn)生高濃度的電子傳遞介體，同時電能達到了 3.1-4.2 W/m2。此外也有文獻報道，在綠膿桿菌接種的微生物燃料電池中檢測出了具有電化學活性的綠膿菌素(pyocyanin)和1_酰胺-吩嗪(phenazine-1-carboxamide),將這些物質(zhì)用于由某些微生物接種的微生物燃料電池時可以明顯提高電池的電流輸出。Rabaey等以綠膿桿菌為陽極微生物，以鐵氰化鉀為陰極電子受體，功率密度達到3.1 4.2 W /m2，研究表明假單胞菌可以通過自身分泌物或代謝產(chǎn)物作為電子傳遞介體
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)電基因工程菌的構建方法、菌株及其應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案為:
一株產(chǎn)電基因工程菌菌株，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAOl-phzM,已于2013年I月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCCNO:M:2013001,本菌在普通LB培養(yǎng)基中就能生長，因可產(chǎn)生大量綠膿素而使菌落呈深藍綠色，抗50 μ g/ml慶大霉素。上述產(chǎn)電基因工程菌菌株的構建方法，以銅綠假單胞菌PAOl菌株為宿主菌，將甲基轉移酶基因插入pBBRlMCS-5載體的EcoRI和SpeI酶切位點之間，再將重組質(zhì)粒導入表達宿主中，獲得產(chǎn)電基因工程菌；具體步驟如下:
1)以銅綠假單胞菌PAOI基因組為模板，PCR擴增出phzim因，連接到測序載體PMD19-TSimple載體,經(jīng)測序與Genebank上公布的序列(Gene ID:880514)比對完全正確后,設計酶切位點EcoRI和Spel，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI雙酶切phzM基因片段和pBBRlMCS-5載體，得到重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-phzM ；
2)將構建好的重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-/7Az#轉化至DH5α感受態(tài)細胞，得到重組大腸桿菌 DH5 a -pBBRlMCS-5-/ ^#,選取陽性克隆；
3 )將鑒定后的陽性克隆的質(zhì)粒電擊轉化導入到銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa PAOl的感受態(tài)細胞中，經(jīng)50 μ g/mL的慶大霉素篩選得到基因工程菌PkOl-phzMo所述產(chǎn)電基因工程菌菌株在微生物燃料電池中的應用，包括如下步驟:
1)菌種活化:將產(chǎn)電基因工程菌/ 仍接種到含有50μ g/ml慶大霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜，挑取平 板上長出的單菌落到5ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜，其中LB培養(yǎng)基配方(1L):蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，若是固體培養(yǎng)基則再加2%瓊脂粉；
2)誘導培養(yǎng):將活化的菌液按照體積比2%的接種量接入25mlLB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，有氧培養(yǎng)菌體OD600至3.7時加入1.34mM的IPTG誘導IOh ；
3)產(chǎn)電:將誘導培養(yǎng)后的菌液與PBS、葡萄糖混合成陽極液接入電池中，電池置于37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，其中陽極液的配比:菌液25ml，10 g/L葡萄糖20ml，50mmol PBS緩沖液5ml ο有益效果:本發(fā)明采用基因工程手段將綠膿素合成途徑中關鍵基因-甲基轉移酶基因在銅綠假單胞菌中進行重組表達，使重組銅綠假單胞菌能夠多產(chǎn)綠膿素2.7倍，從而大幅提高產(chǎn)電能力，與原始菌株相比輸出電壓提高了 2倍，為產(chǎn)電銅綠假單胞菌的基因工程研究奠定了良好的基礎。


圖1銅綠假單胞菌中綠膿素的合成途徑；
圖2表達載體PBBR1MCS-5-/7AZ#的構建圖譜；
圖3表達載體pBBRlMCS-5-/7Az#導入銅綠假單胞菌PAOl的酶切鑒定圖譜；
圖4銅綠假單胞菌PAOl原始菌和基因工程菌PAOI綠膿素產(chǎn)量HPLC圖譜；
圖5銅綠假單胞菌PAOl原始菌輸出電壓 圖6產(chǎn)電工程菌PA01-/7Az#輸出電壓圖；本發(fā)明的產(chǎn)電基因工程菌菌株，其分類命名為銅綠假單胞菌aeruginosa ) VhQl-phzM;其保藏機構全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學；保藏號編號為=CCTCC NO:2013001。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明的生物材料的來源的說明:
1、質(zhì)粒來源:
(1)PMD19-T S imple:購自 Takara 公司；
(2)pBBRlMCS-5:贈自李順鵬教授；申請人在此聲明，保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料。2、基因組模板來源:
銅綠假單胞菌基因組DNA:贈自西北大學段康民教授；
3、原始菌株銅綠假單胞菌PAOl的來源:贈自西北大學段康民教授。4、引物的設計及合成:自行設計并外包金斯瑞生物技術公司合成。實施例1
本實施例說明構建包含表達基因PhzM的中間質(zhì)粒PMD19-T-/7Az#。其過程包括:
1、設計合成不帶有酶切位點的上游引物和下游引物，
Primerl 上游引物:5’ -CGATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCG-3’ ；
Primer2 下游引物:5，- TCACGTATTTTTACAGCA -3，。2、以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段/^KGeneID:880514)，反應條件為:98。C 預變性 2min ;98。C IOs, 60° C 15s, 72。C lmin, 35個循環(huán)后，72°C，5 min，4°C，過夜。PCR擴增出的/7如#基因后，經(jīng)T-A克隆連接到測序載體PMD19-T Simple質(zhì)粒，挑取正確的轉化子，經(jīng)測序，比對正確。實施例2
本實施例說明構建包含表達基因PhzM的中間質(zhì)粒pBBRlMCS-5-/7Az#。其過程包括:
1、設計合成帶有及J酶切位點的上游引物和帶有分e I酶切位點的下游引物(下劃線部分為相應的酶切位點)，
Primerf 上游引物:5’ - CGGAATTCATGAATAATTCGAATCTTGCTGCTGCG-3> ；
Primer4 下游引物:5’ - GGACTAGTTCAGGCCCTGGCAGCGACGATCATGCG-3，。2、以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為:95°C，10 min ；(95°C 30 s，60°C 30s, 72°C 1.5min，35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴增出的
基因(參照Takara DNA片段純化試劑盒說明書)和表達質(zhì)粒pBBRlMCS-5分別用EcoR/和分e I雙酶切、連接轉化至DH5a感受態(tài)細胞(購自Takara公司)，使用汝./JJ酶切鑒定重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-/7Az#，得到兩條帶大小分別是1200bp和4475bp，酶切結果表明，重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-/7Az#構建成功，獲得重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-/7Az#，構建過程見圖2。3、銅綠假單胞菌PAOl的感受態(tài)制作:從銅綠假單胞菌PAOl甘油菌接種于裝液量為5mL LB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量轉接至另一個50mL LB液體培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，37°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)；A_值為0.5左右時終止培養(yǎng)，冰浴IOmin ;4°C，2300Xg離心10 min ;菌體沉淀依次用IOOOmL冰浴SMEB溶液重新懸浮，洗滌菌體；4°C，2300Xg離心10 min，最后根據(jù)菌體量加入不同體積的SMEB溶液混勻；分裝成每管IOOuL電轉化。4、將鑒定后的陽性克隆的質(zhì)粒經(jīng)電擊轉化導入銅綠假單胞菌PAOl的感受態(tài)細胞
(1)重組質(zhì)粒IOul、空質(zhì)粒10ul與銅綠假單胞感受態(tài)細胞IOOuL混勻，加入預冷的
0.2cm電轉化杯中，冰浴IOmin ；
(2)在Bio-Rad電轉化儀上(輸出電壓1.5 kV，電容25uF，電阻200ohm)電擊4
(3)將轉化體系加入冰浴的400uLSOC培養(yǎng)基，轉至1.5 mL的離心管中，37°C，200 r/min振蕩復蘇Ih ；
(4)取IOOuL菌液在含50ug/mL慶大霉素的LB平板篩選；
(5)將平板至于37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)16 18h直至單個菌落出現(xiàn)。次日挑取單菌落，接入含50 μ g/mL慶大霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)1(T12 h后 進行質(zhì)粒提取，經(jīng)EcoRI和SpeI酶切得到陽性轉化子PAOl-phz#，酶切結果見圖3。實施例3
本實施例說明構建成功的含有重組表達質(zhì)粒pBBRlMCS-5-phzM的基因工程菌PA01-/7Az#與出發(fā)菌株PAOl產(chǎn)綠膿素比較。銅綠假單胞菌PAOl原始菌和基因工程菌PA01-/7Az#在5 mL含有相應抗性的種子液中培養(yǎng)過夜，分別轉接至100 1^三角瓶中，當006(|。=3.7時，加入1.34 mM IPTG誘導，10小時后，用HPLC測定綠膿素產(chǎn)量，HPLC圖譜見圖4。色譜柱:C18 ;流動相為A相(水:三氟乙酸==100:0.04，V/V)和D相(乙腈:三氟乙酸=100:0.04，V/V);洗脫方式為梯度洗脫，條件為 A 相 15min，91% A 相和 9% DlOmin, 73% A 相和 27% D 相 20min,67.6% A 相和 32.4%D相20min ;相流速Iml.mirT1 ;柱溫為室溫；檢測波長為250nm,綠膿素出峰時間為30min左右。基因工程菌PA01-/7Az#和原始菌PAOl的綠膿素產(chǎn)量分別為43.36 μ g/mg濕菌體和15.88 μ g/mg 濕菌體。實施例4
本實施例說明構建成功的含有重組表達質(zhì)粒pBBRlMCS-5-phzM的基因工程菌PA01-/7Az#與出發(fā)菌株PAOl產(chǎn)電能力比較。產(chǎn)電能力比較:轉接過夜培養(yǎng)的產(chǎn)電工程菌PAOI和對照菌株PAOl于25mLLB液體培養(yǎng)基中，當0D6(i(i=3.7時，加入1.34 mM IPTG誘導，37° C繼續(xù)誘導培養(yǎng)IOh時混勻于20 mL 50mM PBS緩沖液和5 mL 10g/L葡萄糖中，取24ml注入單室電池中觀察輸出電壓，基因工程菌PAOl-phzM和原始菌PAOl的最高輸出電壓分別為340mV和17OmV，PAOl-MFC及PAOl-phzM-MFC啟動期電壓隨時間的變化見圖5。實施例5
本實施例說明構建的基因工程菌PAOl-phzM的應用。(I)菌種活化:將產(chǎn)電基因工程菌/ 仍接種到含有50 μ g/ml慶大霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜(24tT48h)，挑取平板上長出的單菌落到5ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜(24tT48h)，其中LB培養(yǎng)基配方(IL):蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，若是固體培養(yǎng)基則再加2%瓊脂粉；2)誘導培養(yǎng):將活化的菌液按照體積比2%的接種量接入25mlLB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，有氧培養(yǎng)菌體OD600至3.7時加入1.34mM的IPTG誘導IOh ；
3)產(chǎn)電:將誘導培養(yǎng)后的菌液與PBS、葡萄糖混合成陽極液接入電池中，電池置于37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，最高輸出電壓為350mV左右，其中陽極液的配比:菌液25ml，10 g/L葡萄糖 20ml, 50mmol PBS 緩沖液 5ml。實驗證明，通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，使其得到的重組銅綠假單胞菌可以產(chǎn)更高的電子傳遞體即綠膿素和更高的電量。利用銅綠假單胞菌表達甲基轉移酶以提高產(chǎn)電子傳遞體-綠膿素的量，并最終提高其產(chǎn)電量還未見報道，此為微生物燃料電池提供了一種新穎和可行 的方法。
權利要求
1.一株產(chǎn)電基因工程菌菌株，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAOl-phzM,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO:M 2013001。
2.權利要求1所述產(chǎn)電基因工程菌菌株的構建方法，其特征在于:以銅綠假單胞菌PAOl菌株為宿主菌，將甲基轉移酶基因phzM插入pBBRlMCS-5載體的EcoRI和SpeI酶切位點之間，再將重組質(zhì)粒導入表達宿主中，獲得產(chǎn)電基因工程菌；具體步驟如下: 1)以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAOl基因組為模板，PCR擴增出phzM基因，連接到測序載體PMD19-T Simple載體，經(jīng)測序與Genebank上公布的序列比對完全正確后，設計酶切位點EcoRI和SpeI，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI雙酶切phzM基因片段和pBBRlMCS-5載體后連接得到重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-phzM ； 2)將構建好的重組質(zhì)粒pBBRlMCS-5-phzM轉化至DH5α感受態(tài)細胞，得到重組大腸桿菌 DH5 α -pBBRlMCS-5-phzM,選取陽性克隆； 3)將鑒定后的陽性克隆的質(zhì)粒電擊轉化導入到銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAOl的感受態(tài)細胞中，經(jīng)50 μ g/mL的慶大霉素篩選得到基因工程菌PAOl-phzMo
3.權利要求1所述產(chǎn)電基因工程菌菌株在微生物燃料電池中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于包括如下步驟: 1)菌種活化:將產(chǎn)電基因工程菌PAOl-phzM接種到含有50μ g/ml慶大霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜，挑取平板上長出的單菌落到5ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過夜； 2)誘導培養(yǎng):將活化的菌液按照體積比2%的接種量接入LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，有氧培養(yǎng)菌體OD600至3.7時加入1.34mM的IPTG繼續(xù)誘導培養(yǎng)10h ； 3)產(chǎn)電:將誘導培養(yǎng)后的菌液與PBS、葡萄糖混合成陽極液接入電池中，其中陽極液的配比:菌液25ml,10 g/L葡萄糖20ml, 50mmol PBS緩沖液5ml。
全文摘要
一株產(chǎn)電基因工程菌菌株，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1-phzM，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC NOM2013001。該菌株以銅綠假單胞菌PAO1菌株為宿主菌，將甲基轉移酶基因phzM插入pBBR1MCS-5載體的EcoRI和SpeI酶切位點之間，再將重組質(zhì)粒導入表達宿主Pseudomonas aeruginosa PAO1中獲得。本發(fā)明采用基因工程手段將綠膿素合成途徑中關鍵基因-甲基轉移酶基因phzM在銅綠假單胞菌中進行重組表達，使重組銅綠假單胞菌能夠多產(chǎn)綠膿素2.7倍，從而大幅提高產(chǎn)電能力，與原始菌株相比輸出電壓提高了2倍。
文檔編號C12N1/21GK103184185SQ20131003301
公開日2013年7月3日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權日2013年1月29日
發(fā)明者陳怡露, 鄭濤, 施冬艷, 許琳, 雍曉雨, 沈海波, 曹琳, 徐俊 申請人:南京工業(yè)大學